BOECを用いたvon Willebrand病の細胞科学的的解析と治療への応用

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17K09902
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 松下 正 名古屋大学, 医学部附属病院, 教授 (30314008)
• 研究分担者: 鈴木 伸明 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (70637686)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 血栓止血学 / von Willebrand因子 / BOEC / von Willebrand病 / multimer / Weibel-Palade body / DDAVP

研究実績の概要

令和元年度は実際の患者の末梢血から採取した血管内皮前駆細胞（EPCs）を培養して得られる血管内皮細胞（BOECs、現在はendothelial colony forming cells (ECFC)と呼ばれることが多い）を用い、VWF発現の影響を調査して分子病態解析を行った。
培養方法：患者末梢静脈血約60mlを採取→遠心分離した単核球層を1型コラーゲンをコートした6-wellプレート上に、4x107 MNC/wellとなるようresuspendし、EGM-2メディウム下にてⅠ型collagenコート6 well plateに播種、37℃ 5%CO2下で培養を行った。
結果：健康成人コントロール2例、患者10例中5例で最初の培養過程で細胞は典型的なcobblestone形態をとった。フローサイトメトリーにて細胞はCD31(+) VEGFR-2(+) CD14(-) CD45(-) CD133(-) CD34(-)であった。陽性コントロールにはHUVECを用いた。VWFの細胞学的な発現様式はconfocal immunofluorescence (IF)にて観察した。固定後FITC標識抗体を用いて蛍光染色を行い、M0616(抗VWF)による染色は良好で、phalloidin555(f-actin)との二重染色にて細胞骨格蛋白とは共在しないVWFの発現を認めた。
健常人由来ECFCにて、100-150ng/mlのVWFの分泌を培養上清中に認めたが、type 1、type 3と考えられる症例では全く発現は見られなかった。VWF:Ag、VWF:RCoともに検出感度以下の臨床的にtype 3と考えられる症例では全く発現は見られなかったが、同様な検査結果を示す臨床的に重症な type 1と考えられる症例において培養開始Day34においてVWF陽性細胞が少数確認された。観察を行った細胞はLysateを調整し、Western blottingにてVWFのプロセシングを確認中である。
本法の免疫染色により、type 1とtype 3の鑑別において小胞体(細胞内Dimer形成場所)やGolgi体(細胞内Multimer形成)と共染色することでVWFの存在様式を推定することが可能であった。

研究成果

• [雑誌論文] A Japanese multi-institutional collaborative study of antigen-positive red blood cell (RBC) transfusions in patients with corresponding RBC antibodies. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamada C, Takeshita A, Ohto H, Ishimaru K, Kawabata K, Nomaguchi Y, Haraguchi Y, Abe M, Sobue K, Takenouchi H, Takadate J, Kamimura M, Katai A, Kasai D, Minami Y, Sugimoto T, Michino J, Nagai K, Kumagai M, Hasegawa Y, Ishizuka K, Ohtomo N, Yamada N, Muroi K, Matsushita T, Takahashi K.
  • 雑誌名: Vox Sang. 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1111/vox.12906
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Higher FVIII:C measured by chromogenic substrate assay than by one-stage assay is associated with silent hemophilic arthropathy. (2020)
  • 著者名/発表者名: Ogawa M, Suzuki N, Takahashi N, Tamura S, Suzuki A, Suzuki S, Hattori Y, Kakihara M, Kanematsu T, Kojima T, Katsumi A, Hayakawa F, Kojima T, Ishiguro N, Kiyoi H, Matsushita T.
  • 雑誌名: Thromb Res. 巻: 188 ページ: 103-105
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2020.01.003
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Safety and efficacy of turoctocog alfa in the prevention and treatment of bleeds in previously untreated paediatric patients with severe haemophilia A: Results from the guardian 4 multinational clinical trial. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yaish H, Matsushita T, Belhani M, Jimenez-Yuste V, Kavakli K, Korsholm L, Matytsina I, Philipp C, Reichwald K, Wu R.
  • 雑誌名: Haemophilia. 巻: 26(1) ページ: 64-72.
  • DOI: 10.1111/hae.13883
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Successful Perioperative Combination of High-Dose FVIII Therapy Followed by Emicizumab in a Patient with Hemophilia A with Inhibitors. (2019)
  • 著者名/発表者名: Okamoto S, Suzuki N, Suzuki A, Suzuki S, Tamura S, Suzuki M, Takahashi N, Kojima T, Kanematsu T, Kojima T, Kiyoi H, Ishiguro N, Matsushita T.
  • 雑誌名: TH Open. 巻: 3(4) ページ: e364-e366
  • DOI: 10.1055/s-0039-3401001
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Subcutaneous concizumab prophylaxis inhemophilia A and hemophilia A/B with inhibitors: Phase 2 trial results. (2019)
  • 著者名/発表者名: Shapiro AD, Angchaisuksiri P, Astermark J, Benson G, Castaman G, Chowdary P,Eichler H, Jimenez-Yuste V, Kavakli K, Matsushita T, Poulsen LH MS, Wheeler AP,Young G, Zupancic-Salek S, Oldenburg J.
  • 雑誌名: Blood 巻: 134(22) ページ: 1973-1982
  • DOI: 10.1182/blood.2019001542.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Using pharmacokinetics for tailoring prophylaxis in people with hemophilia switching between clotting factor products: A scoping review. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yu JK, Iorio A, Edginton AN; WAPPS co‐investigators.
  • 雑誌名: Res Pract Thromb Haemost. 巻: 3(3) ページ: 528-541
  • DOI: 10.1002/rth2.12204.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Performance evaluation of Revohem(TM) FVIII chromogenic and Revohem(TM) FIX chromogenic in the CS-5100 autoanalyser. (2019)
  • 著者名/発表者名: Suzuki A, Suzuki N, Kanematsu T, Shinohara S, Arai N, Kikuchi R, Matsushita T.
  • 雑誌名: Int J Lab Hematol. 巻: 41(5) ページ: 664-670
  • DOI: 10.1111/ijlh.13083.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Apolipoprotein E binds to and reduces serum levels of DNA-mimicking, pyrrolated proteins. (2019)
  • 著者名/発表者名: Hirose S, Hioki Y, Miyashita H, Hirade N, Yoshitake J, Shibata T, Kikuchi R, Matsushita T, Chikazawa M, Itakura M, Zhang M, Nagata K, Uchida K.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 294(28) ページ: 11035-11045
  • DOI: 10.1074/jbc.RA118.006629
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Apparent synonymous mutation F9 c.87A>G causes secretion failure by in-frame mutation with aberrant splicing. (2019)
  • 著者名/発表者名: Odaira K, Tamura S, Suzuki N, Kakihara M, Hattori Y, Tokoro M, Suzuki S, Takagi A, Katsumi A, Hayakawa F, Okamoto S, Suzuki A, Kanematsu T, Matsushita T, Kojima T.
  • 雑誌名: Thromb Res. 巻: 179 ページ: 95-103
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2019.04.022.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Systematic review and analysis of efficacy of recombinant factor IX products for prophylactic treatment of hemophilia B in comparison with rIX-FP. (2019)
  • 著者名/発表者名: Davis J, Yan S, Matsushita T, Alberio L, Bassett P, Santagostino E.
  • 雑誌名: J Med Econ. 巻: 22(10) ページ: 1014-1021
  • DOI: 10.1080/13696998.2019.1620246.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Molecular basis of SERPINC1 mutations in Japanese patients with antithrombin deficiency. (2019)
  • 著者名/発表者名: Tamura S, Hashimoto E, Suzuki N, Kakihara M, Odaira K, Hattori Y, Tokoro M, Suzuki S, Takagi A, Katsumi A, Hayakawa F, Suzuki A, Okamoto S, Kanematsu T, Matsushita T, Kojima T.
  • 雑誌名: Thromb Res. 巻: 178 ページ: 159-170
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2019.04.004.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Factor VIII: Long-established role in haemophilia A and emerging evidence beyond haemostasis. (2019)
  • 著者名/発表者名: Samuelson Bannow B, Recht M, Negrier C, Hermans C, Berntorp E, Eichler H, Mancuso ME, Klamroth R, O'Hara J, Santagostino E, Matsushita T, Kessler C.
  • 雑誌名: Blood Rev. 巻: 35 ページ: 43-50
  • DOI: 10.1016/j.blre.2019.03.002.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 血友病Aに対するrVIII-SingleChain 第I/III相臨床試験における日本人患者サブ解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 日笠 聡, 長尾 梓, 福武 勝幸, 松下 正, 鈴木 伸明, 山本 晃士, 嶋 緑倫, 野上 恵嗣, 佐藤 哲司, 康 勝好, 脇 研自, 藤原 充弘, 佐藤 直仁, 古林 みどり, 桑原 光弘
  • 雑誌名: 日本血栓止血学会誌 巻: 30巻4号 ページ: 625-631
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] フィブリノゲン抗原量測定試薬「ファクターオートフィブリノーゲン」のCS-5100用新規アプリケーション設定 (2019)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 敦夫, 池谷 均, 菊地 良介, 安藤 善孝, 松下 正
  • 雑誌名: 医学検査 巻: 68巻3号 ページ: 519-524
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] トロンビン試薬の原材料変更によるフィブリノゲン測定への影響の検証 (2019)
  • 著者名/発表者名: 井上 結以, 鈴木 敦夫, 亀山 なつみ, 前田 奈弥, 山本 ゆか子, 菊地 良介, 安藤 善孝, 松下 正
  • 雑誌名: 医学検査 巻: 68巻3号 ページ: 494-500
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 科学的根拠に基づいた新鮮凍結血漿(FFP)の使用ガイドライン[改訂第2版] (2019)
  • 著者名/発表者名: 松下 正, 長谷川 雄一, 玉井 佳子, 宮田 茂樹, 安村 敏, 山本 晃士, 松本 雅則, 日本輸血・細胞治療学会「ガイドライン委員会」, 新鮮凍結血漿の使用指針に関する小委員会
  • 雑誌名: 日本輸血細胞治療学会誌 巻: 65(3) ページ: 525-537
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] 【ICU治療指針 II】血液・凝固線溶系疾患と管理 血液・凝固線溶系疾患 後天性血友病 (2019)
  • 著者名/発表者名: 兼松 毅, 松下 正
  • 雑誌名: 救急・集中治療 巻: 31(3) ページ: 956-958
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] 【ICU治療指針 II】血液・凝固線溶系疾患と管理 血液・凝固線溶系疾患血友病・von Willebrand病 (2019)
  • 著者名/発表者名: 兼松 毅, 松下 正
  • 雑誌名: 救急・集中治療 巻: 31(3) ページ: 951-955
  • オープンアクセス
• [学会発表] 東海ブロックにおけるHIV-1非サブタイプBの動向調査と伝播性薬剤耐性変異の頻度解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 岡﨑玲子、重見麗、松田昌和、矢野邦夫、鶴見寿、奥村暢将、谷口晴記、志智大介、池谷健、伊藤公人、松下正、羽柴智恵子、中畑征史、小暮あゆみ、今橋真弓、今村淳治、岩谷靖雅、杉浦亙、吉村和久、蜂谷敦子、横幕能行
  • 学会等名: 第33回日本エイズ学会学術集会
• [学会発表] 血友病Ａにおけるassay discrepancy 評価のための凝固一段法試薬のバリエーション (2019)
  • 著者名/発表者名: 鈴木敦夫、鈴木伸明、兼松毅、安藤善孝、松下正
  • 学会等名: 第66回日本臨床検査医学会学術集会
• [学会発表] ＶＥＧＦ－Ａの質に着目したＡＮＣＡ関連血管炎の治療効果評価に寄与する評価法構築に向けて (2019)
  • 著者名/発表者名: 菊地良介、坪井直毅、丸山彰一、室原豊明、松下正
  • 学会等名: 第66回日本臨床検査医学会学術集会
• [学会発表] Management of Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia in Type 1 CD36 Deficiency Pregnant Women (2019)
  • 著者名/発表者名: Tadashi Matsushita, Naomi Sanda, Tomomi Watanabe, Hiroko Endo, Chiaki Kato
  • 学会等名: 2019AABB Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Effectiveness and Safety of Real-World Treatment with BAY 94-9027 in Previously Treated Patients with Hemophilia A: Rationale and Design of the HEM-POWR Study (2019)
  • 著者名/発表者名: Martin Sanabria, Maria Teresa Alvarez Roman, Giancarlo Castaman,Maissaa Janbain,Tadashi Matsushita, Karina Meijer,Johannes Oldenburg,Mark Reding, Sabine Friedl
  • 学会等名: International Soceity on Thrombosis and Haemostasis(ISTH) 2019
  • 国際学会
• [学会発表] Subcutaneous prophylaxis with the anti-TFPI monoclonal antibody concizumab in haemophilia A and haemophilia A/B with inhibitors: Phase 2 trial results (2019)
  • 著者名/発表者名: Jan Astermark, Pantep Angchaisuksiri, Gary Benson, Giancarlo Castaman, Pratima Chowdary, Hermann Eichler, Victor Jimenez-Yuste, Kaan Kavakli, Tadashi Matsushita, Lone Hvitfeldt Poulsen, Johannes Oldenburg, Amy Shapiro, Allison P. Wheeler, Silva Zupancic-Salek, Guy Young
  • 学会等名: International Soceity on Thrombosis and Haemostasis(ISTH) 2019
  • 国際学会
• [学会発表] 血友病治療の発展とエイジングケア (2019)
  • 著者名/発表者名: 松下正
  • 学会等名: 第41回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] 血友病A治療における第VIII因子製剤の位置づけ (2019)
  • 著者名/発表者名: 松下正
  • 学会等名: 第41回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] 新規伸長型変異を認めた先天性血液凝固第XI 因子欠乏症の1例 (2019)
  • 著者名/発表者名: 早川友梨，田村彰吾，鈴木伸明，大平晃也，垣原美紗樹，服部有那，所真昼，河島史華，鈴木幸子，早川文彦，高木明，岡本修一，兼松毅，松下正，小嶋哲人
  • 学会等名: 第41回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] GPlb変異体を用いたvon Willebrand 因子活性測定試薬の基本性能評価 (2019)
  • 著者名/発表者名: 鈴木敦夫，鈴木伸明，兼松毅，岡本修一，篠原翔，新井信夫，安藤善孝，松下正
  • 学会等名: 第41回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] FACTOR THERAPYとNON-FACTOR THERAPY (2019)
  • 著者名/発表者名: 松下正
  • 学会等名: Hemophilia Update in Tokai
• [学会発表] 血友病治療における凝固因子活性測定の展望 (2019)
  • 著者名/発表者名: 松下正
  • 学会等名: 第25回北海道血友病研究会
• [学会発表] 新しい新鮮凍結血漿使用ガイドラインと大量輸血における使い方 (2019)
  • 著者名/発表者名: 松下正
  • 学会等名: 第67回日本輸血・細胞治療学会学術総会
• [学会発表] Myh9 R702C is associated with altered erythropoiesis in mice (2019)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Kanematsu, Nobuaki Suzuki, Atsuo Suzuki, Shogo Tamura, Shuichi Okamoto, Yuichi Ishikawa, Akira Kasumi, Hitoshi Kiyoi, Hidehiko Saito, Shinji Kunishima, Tetsuhito Kojima, Tadashi Matsushita
  • 学会等名: 第81回日本血液学会学術集会
• [学会発表] The Development of National Guideline for Use of Blood Products (2019)
  • 著者名/発表者名: Tadashi Matsushita
  • 学会等名: Asia Pacific Conference of Transplantation Immunogenetics and Blood Transfusion 2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 血友病診療の手段とその進歩 (2019)
  • 著者名/発表者名: 松下正
  • 学会等名: つくば血友病フォーラム
• [学会発表] 血友病診療における凝固因子検査の展望 (2019)
  • 著者名/発表者名: 松下正
  • 学会等名: 第13回北海道止血・血栓研究会