鉄芽球性貧血モデル細胞を用いたミトコンドリア鉄蓄積機構の解明

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K09910
• 研究機関: 岩手医科大学
• 研究代表者: 金子 桐子 岩手医科大学, 医学部, 講師 (10545784)
• 研究分担者: 古山 和道 岩手医科大学, 医学部, 教授 (80280874)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: ヘム合成 / 鉄代謝

研究実績の概要

本研究はミトコンドリアにおける鉄蓄積機構の解明を目的に、今年度は以下の2項目について検討を行なった。
1. HA2low1細胞を用いた鉄蓄積機構の解析：先行研究にて作製した、赤血球型アミノレブリン酸合成酵素(ALAS2)のエンハンサー領域に変異を導入したX連鎖性鉄芽球性貧血モデル細胞(以下 HA2low1細胞）を用いて、細胞質およびミトコンドリアにおいて鉄輸送に関与する因子の発現検討を行なった。その結果、赤血球分化誘導時にdivalent metal transporter 1 、mucolipin 1 mRNA発現がそれぞれ野生型と比較してHA2low1細胞では有意に増加した。これらのmRNA発現増加はHA2low1細胞においてミトコンドリアへの鉄輸送が野生型より促進されている可能性を示唆した。
2. ALAS2以外の遺伝子変異を持つ鉄芽球性貧血モデル細胞作製：遺伝性鉄芽球性貧血の原因遺伝子であるGLRX5, SLC25A38および後天性鉄芽球性貧血で変異が多く報告されている SF3B1 それぞれの遺伝子に変異を導入して鉄芽球性貧血モデル細胞作製を29年度に引き続いて行った。これらの遺伝子変異導入は以前に行なったALAS2への変異導入と同様の手法では変異の導入が困難であったことから、30年度は各遺伝子の標的配列に最適な導入方法およびCRISPR/Cas9発現手段の再検討を行なった。その結果、初めに検討を着手したGLRX5遺伝子への変異導入に成功し、現在表現系の確認を進めている。 また、SLC25A38, SF3B1についても順次、変異導入条件の改善検討を行なっている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

鉄芽球性貧血モデル細胞の作成が3種類作成する予定を変更し、優先順位を設けて１遺伝子ずつ変異導入条件の検討を行なったことから、30年度に変異細胞を作成できたのはGLRX5のみであった。現在、SLC25A38, SF3B1についても導入条件検討を行なっている。
一方、ALAS2変異によるミトコンドリア鉄蓄積機構解析はおおむね予定通りの進捗状況である。

今後の研究の推進方策

1. HA2low1細胞を用いて、30年度に見出した2つの遺伝子について発現増加の機序およびその発現変化による鉄蓄積機構の解析を行い、本研究の達成を目指す。また、これまで検討を行なってきたミトコンドリアフェリチンの発現機構についても引き続き解析を行う予定である。
2. 鉄芽球性貧血モデル細胞作成は、GLRX5については予定通り表現系の確認および鉄蓄積機構の解析を行う予定である。一方、SLC25A38, SF3B1への変異導入検討を引き続き行う。変異導入後にはGLRX5同様の解析を行う。変異導入が困難な場合を考慮し、新たなゲノム編集方法および導入方法の準備を並行して進めながら新たな鉄芽球性貧血モデル細胞の樹立、解析を目指す方策である。

次年度使用額が生じた理由

調達方法の工夫により、当初計画より経費の使用が節約できたことにより生じた未使用額である。 次年度は物品費として消耗品の購入に充てる計画である。

研究成果

• [雑誌論文] ATP6AP2 variant impairs CNS development and neuronal survival to cause fulminant neurodegeneration (2019)
  • 著者名/発表者名: Hirose T, Cabrera-Socorro A, Chitayat D, Lemonnier T, Feraud O, Cifuentes-Diaz C, Gervasi N, Mombereau C, Ghosh T, Stoica L, Bacha Jeanne d’Arc Al, Yamada H, Lauterbach M A, Guillon M, Kaneko K, Norris Joy W, Siriwardena K, Blaser S, Teillon J, Mendoza-Londono R, Russeau M, Hadoux J, Ito S, Corvol P, et al.
  • 雑誌名: Journal of Clinical Investigation 巻: 129 ページ: 2145～2162
  • DOI: 10.1172/JCI79990
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Establishment of a cell model of X-linked sideroblastic anemia using genome editing (2018)
  • 著者名/発表者名: Kaneko Kiriko、Kubota Yoshiko、Nomura Kazumi、Hayashimoto Haruka、Chida Taisei、Yoshino Naoto、Wayama Marina、Ogasawara Katsutoshi、Nakamura Yukio、Tooyama Ikuo、Furuyama Kazumichi
  • 雑誌名: Experimental Hematology 巻: 65 ページ: 57～68.e2
  • DOI: 10.1016/j.exphem.2018.06.002
  • 査読あり
• [学会発表] 赤芽球における鉄蓄積機構解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 金子桐子
  • 学会等名: 第91回 日本生化学会年会
  • 招待講演