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本年度においては、CRISPR/Cas9 systemを用いて、高度に濃縮されたヒト造血幹細胞から遺伝子をノックアウトする技術の手法の改善を行った。
具体的には、Cas9タンパク質の導入法を、従来のプラスミドベクターからリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体を用いる方法に変更した。さらに、Cas9タンパク質導入後の培養時に用いる培地を市販の無血清培地から、自家調整の培地に変更した。これらの変更により、造血幹細胞からの遺伝子ノックアウト効率が飛躍的に改善した。予備的検討として、ヒト造血幹細胞のマーカーである、CD34抗原のノックアウトを行ったところ、CRISPR/Cas9導入後わずか72時間後の解析において、およそ50%の細胞でCD34抗原の欠失が認められた。従来のプラスミドベクターを用いた際のCD34抗原のノックアウト効率は10%程度であったことを考えると、今回の技術改良は本研究を進めるうえで、非常に有用であることと考えられた。この方法を用いると、非常に短時間に目的遺伝子をノックアウト可能であることから、培養下でのヒト造血幹細胞活性の損失が最小限に抑えられ、ヒト造血幹細胞支持因子およびその受容体の機能解析をin vitroおよびin vivoで正確に評価できるものと考えられる。
一方で、ヒト造血幹細胞に対する結合性を有する抗体ライブラリーを用いた、ヒト骨髄間質細胞によるヒト造血幹細胞支持能の阻害抗体のスクリーニングも予定通り進行しており、今後、候補抗体の認識する抗原を、質量分析で同定した後、上記CRISPR/Cas9 systemを用いてその機能を解析する予定である。
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