| 研究課題/領域番号 |
17K09995
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
須藤 明 千葉大学, 大学院医学研究院, 准教授 (50447306)
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| 研究分担者 |
鈴木 浩太郎 千葉大学, 大学院医学研究院, 准教授 (90554634)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 自己免疫性筋炎 |
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| 研究実績の概要 |
自己免疫疾患の発症には、免疫寛容の破綻による自己反応性T細胞の活性化が関与する。自己免疫応答には、IL-17,IL-21,GM-CSFを産生し自己免疫疾患を惹起するTh17細胞と抑制性に機能する制御性T細胞との分化バランスが深く関与しており、IL-21はTh17細胞の自己増殖因子として機能し、また濾胞ヘルパーT細胞からも産生され、B細胞の形質細胞への分化、自己抗体の産生を誘導するとともに、CD8陽性T細胞にも直接作用し、細胞傷害性の増強に関与している。本研究者は炎症性筋疾患患者の血清IL-21濃度が、健常者と比して有意に上昇していていることを見出した。しかしながら、IL-21の自己免疫性筋炎の発症における役割はいまだ不明であった。そこで本研究者は実験的自己免疫性筋炎の発症におけるIL-21の役割を解析した。その結果、IL-21欠損マウスは野生型マウスに比して、筋力低下が有意に改善し、筋肉への浸潤細胞はCD11b陽性の骨髄球系細胞および好中球が有意に低下していた。さらに炎症性サイトカインの網羅的な解析では、GM-CSFの産生がIL-21欠損マウスで有意に低下しており、特にγδT細胞からのGM-CSFの産生が著しく低下していることを見出した。筋肉に浸潤するγδT細胞のTCRレパトワの解析では、GM-CSFの主要な産生細胞はVγ4陽性Vδ4陽性のγδT細胞であり、ケモカイン受容体の解析ではCCR3, CCR6, CCR8, CXCR4, およびCX3CR1が高発現であった。特に、IL-21欠損マウスの筋浸潤γδT細胞のCX3CR1の発現は野生型マウスと比較して有意に低下していた。これらの結果、IL-21はCX3CR1陽性Vγ4陽性Vδ4陽性γδT細胞の筋への浸潤を増強することにより自己免疫性筋炎の発症に関わっていることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成30年度は研究計画２.GM-CSF産生γδT細胞の筋集積機構の解析および、研究計画３.GM-CSF産生γδT細胞におけるGM-CSF産生機構の解析を予定していたが、下記に示すように概ね順調に達成している。
研究計画２.GM-CSF産生γδT細胞の筋集積機構の解析:
実験的自己免疫性筋炎を誘導したマウスの筋内と所属リンパ節のGM-CSF産生γδT細胞、及びコントロールとしてリンパ節のγδT細胞を単離し、サイトカイン及びケモカイン受容体の発現を網羅的に解析した。その結果、筋肉に浸潤するγδT細胞のTCRレパトワの解析では、GM-CSFの主要な産生細胞はVγ4陽性Vδ4陽性のγδT細胞であり、ケモカイン受容体の解析ではCCR3, CCR6, CCR8, CXCR4, およびCX3CR1が高発現であった。特に、IL-21欠損マウスの筋浸潤γδT細胞のCX3CR1の発現は野生型マウスと比較して有意に低下していた。これらの結果、IL-21はCX3CR1陽性Vγ4陽性Vδ4陽性γδT細胞の筋への浸潤を増強することにより自己免疫性筋炎の発症に関わっていることが示唆された。
研究計画３.GM-CSF産生γδT細胞におけるGM-CSF産生機構の解析
筋肉におけるケモカインの発現を検討し、CX3CR1のリガンドであるCX3CL1の発現が、実験的自己免疫性筋炎を誘導したIL-21欠損マウスで著しく低下していた。さらにレポーターアッセイにてIL-21がCX3CL1プロモーターを活性化することを見出した。これらの結果、IL-21はCX3CR1-CX3CL1パスウェイによりGM-CSF産生Vγ4陽性Vδ4陽性γδT細胞の筋肉への浸潤を誘導することにより自己免疫性筋炎の発症に関わっていることが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究計画として以下の研究計画３.GM-CSF産生γδT細胞におけるGM-CSF産生機構の解析および、研究計画４. 炎症性筋疾患患者におけるIL-21及びGM-CSF産生細胞の解析を予定している。。
研究計画３.GM-CSF産生γδT細胞におけるGM-CSF産生機構の解析：筋内、及び所属リンパ節のGM-CSF産生γδT細胞に特異的に発現する転写因子を網羅的に同定する。γδT細胞をIL-21で刺激した際に発現誘導される転写因子の網羅的解析結果とあわせ、GM-CSF産生誘導の候補転写因子を抽出する。さらに候補転写因子の発現レトロウィルスベクターとノックダウンレトロウィルスベクターを作成し、CD4陽性T細胞およびγδT細胞に発現させ、GM-CSF産生を細胞内染色にて評価する。また候補転写因子の遺伝子欠損マウスを入手、或いはCRISPR-Cas9システムを用いて独自に樹立し、そのマウスのγδT細胞におけるGM-CSF産生能を検討する。他方クロマチン免疫沈降法により、候補転写因子のGM-CSF遺伝子座への結合を確認する。
研究計画４. 炎症性筋疾患患者におけるIL-21及びGM-CSF産生細胞の解析(担当：須藤)
1) 未治療皮膚筋炎・多発性筋炎患者(10名)、及び外来で治療中の皮膚筋炎・多発性筋炎患者(50名)からPBMCsを採取し、1) IL-21を産生する細胞分画、2) GM-CSFを産生する細胞分画、3) GM-CSFを産生するγδT細胞のTCRレパトワ、4)研究計画2.2)で同定したケモカイン受容体の発現、5) 研究計画3.2)で同定したGM-CSF産生に関与する転写因子の発現を解析する。また、本解析データと臨床指標（病型、疾患活動性、各種筋炎関連自己抗体、治療反応性など）との相関を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度以降の研究計画3の中和抗体の購入やRNA-シーケンス解析の費用が高額のため、次年度以降に充当する計画とした。
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