| 研究課題/領域番号 |
17K10003
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
松尾 裕彰 広島大学, 病院(医), 教授 (60346385)
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| 研究分担者 |
横大路 智治 広島大学, 医歯薬保健学研究科(薬), 准教授 (70389120)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 食物アレルギー / エビ / 抗原 / FDEIA |
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| 研究実績の概要 |
エビによる食物依存性運動誘発アナフィラキシー（FDEIA）患者を診断する目的で行われる食物運動負荷試験の感度は低い。同様に、現行のエビ特異IgE抗体価検査についても、偽陰性を示すケースが多い。食物運動負荷試験の精度が悪い原因は、症状誘発に必要なエビの摂取量や運動負荷量が患者ごとに異なるためであると考えられている。また、負荷試験や特異IgE抗体検査に用いられるエビの種類の違いによって、検査結果が異なることが示唆されている。本研究では、本邦で食用とされているエビの原因抗原を精製し、エビ種間の抗原の違いを明らかにすると共に、診断への応用を試みる。
これまでの検討において、エビのfructose 1,6-bisphosphate aldolase (FBA)およびNesprin-1ホモログが原因抗原であることを明らかにし、これらの抗原に対するIgEの反応性がエビの違いにより異なることを示した。今年度の研究では、エビNesprin-1ホモログの精製法を検討した。その結果、バナメイエビのむき身を40 mM Tris-HCl (pH 8.0)緩衝液とホモジナイズすることによりタンパク質を抽出し、40-60%硫酸アンモニウム分別沈殿により濃縮する。濃縮タンパク質を10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0) で透析した後、アセトニトリルを30%含む10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0) で希釈し、逆相C4カラム (YMC-Pack C4)にかけ、アセトニトリル30%から70%の条件でグラジエント溶出することにより分離精製することができることを明らかにした。現在、FBAを効率よく精製する方法の検討、ならびに、複数のエビFDEIA患者血清を用いて精製抗原へのIgEの結合解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今回、エビFDEIAの原因抗原として同定した2種の抗原のうちNesprin-1ホモログの効率の良い精製方法を確立したが、精製方法を検討する際、変性による抗原の失活を可能な限り少なくすることを目的に、カラムの種類や溶出条件の検討を数多く行ったため、精製方法の確立までに時間を要した。FBAの精製法についても同様の検討を進めており、単一タンパク質として精製するためには、さらに精製条件の改良が必要であることが分かっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度には、抗原を大量に精製し、ELISAまたはImmunoCAPに応用し、エビアレルギーの新規in vitro診断法の開発を試みる。また、精製方法を確立した後、異なる種類のエビよりFBAおよびNesprin-1ホモログを精製し、質量分析計を利用してアミノ酸配列を解析する。配列を比較することで、エピトープを予測し、各種エビ間での交差反応性についても解析する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入品の見積額が誤っていたため144円を次年度へ繰り越すことになりました。
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