| 研究課題/領域番号 |
17K10006
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
竹内 恵美子 北里大学, 医学部, 講師 (00406935)
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| 研究分担者 |
大津 真 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (30361330) [辞退]
竹内 康雄 北里大学, 医学部, 教授 (60286359)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 好中球NETosis / 慢性肉芽腫症 / Apoptosis / 制御性細胞死 |
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| 研究実績の概要 |
好中球NETosisは抗核抗体の一因でありSLEなどの抗核抗体陽性自己免疫疾患の増悪因子である。NETosisがおこる機序には不明な点が多いが、NOX2の活性化によ る活性酸素種（ROS)の産生がその引き金となると考えられている。本研究課題はNOX2を欠損した慢性肉芽腫症モデルマウス(CGD)とwild type（wt）との比較に よってROS産生がNETosisにもたらす影響を検討することを目的とする.
今までの研究成果により分離したマウスの好中球に自己核タンパクの一つであるRNPとanti-RNP抗体の複合体を添加するとNOX2 independentにミトコンドリアのROS産生が促され、Netosisが起こるということがわかっていたが、我々は抗原抗体複合体のみならず抗原であるRNPのみでマウス好中球に確実にNETosisを誘導できる条件を決定し、time lapsにより細胞外にゲノムDNAが放出される様子を捕えることに成功した。また、好中球は個体内ではNETosisだけでなく、Apoptosisやpyroptosisなどの何通りかの細胞死パターンを組み合わせることで炎症の大きさそのものを制御していると考えられるので、ある刺激に対して好中球がどのようなバランスでNETosisとApoptosisを起こすか、リン酸化ｐ３８とcleaved-Caspase3の細胞内二重染色によって細胞のFateをFACSで評価できるようにした。これにより、Cl-amidinやp38 inhibitorなどのNETosis抑制に用いる化合物が細胞死をApoptosisへ誘導しているかをin vitroであらかじめ確認することができるようになった。さらに、これらの結果をin vivoで検証するよう動物の炎症モデルの作成を検討していたが、Zymosanの腹腔内投与により肉芽腫病変を中心にした好中球炎症が惹起でき血清DNAなどの測定でこれを評価することができることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒトの好中球研究が進んでいるのに比べてマウスのNetosisに関する報告が少ないのは、マウスの好中球にNETosisを誘導するのが困難であると一般に考えられているからである。実際にマウスの好中球NETosisは培養液の組成やNetosis検出のために蛍光色素化合物の組み合わせなどの微妙な変化によって大きく結果が異なることがしばしばあるが、我々は失敗を重ねた結果確実にNETosisを起こす条件を得ることができた。また、in vitroの結果を応用するためのin vivoの炎症誘導プロトコールも出来上がりつつあるため、今後は研究の進展がみられると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までの実験で、好中球がNetosisを起こすところをtime lapsにより記録することに成功したが、RNP抗原の添加によってミトコンドリアのROS産生が増加し引き続いてゲノムDNAの放出が起こることを画像としてとらえるために、ミトコンドリアROSにより蛍光を発する試薬であるMitoSoxも加えたところ、加えない場合に比べて細胞死が急速に激しく起きてしまったため解析に十分な画像にならなかった。今後は条件を調整し、DNA放出によるSytox輝度増強の前にMitosoxの輝度が上がっていることを定量的に示せるようにする。
さらに、in vivoモデルについては血清DNA量の変化があることが現在までの実験でえられているが、この中にミトコンドリア由来の酸化DNAが含まれていることと、これによりtype1 IFNの分泌が亢進していることを同時に明らかにしていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マウスの好中球を単離するためにmagnetic beadsを利用したisolation kitを用いているが、残金は１kitを購入するのに4000円足りないので、次年度に繰り越してkit購入に充てる予定である。
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