2019 年度実施状況報告書

血清中におけるインフルエンザウイルス亜型間交叉反応性中和抗体の検出法の確立

研究課題

研究課題/領域番号	17K10037
研究機関	藤田医科大学
研究代表者	大島信子藤田医科大学, 国際再生医療センター, 講師 (60387694)
研究期間 (年度)	2017-04-01 – 2021-03-31
キーワード	中和抗体検出法
研究実績の概要	本研究では、過去の研究において単離し、エピトープ解析を行ったインフルエンザウイルス中和抗体を用いて、インフルエンザウイルスに対し中和活性を有しかつ、様々な変異株及び亜型に交差反応する血中の抗インフルエンザウイルス中和抗体の検出系を構築することを目的として研究を行っている。昨年度までにA型インフルエンザウイルスのうち、グループ1に属する亜型及び変異ウイルス株に対し交差反応する血中抗体の検出系を構築し検証したところ、インフルエンザワクチン接種前後の血清中の抗体検出が可能であったことから、本年度では他の亜型のウイルス株に対する検出系の構築を試みた。ヘマグルチニンに対する中和エピトープが判明しているH3亜型に対する交差反応性抗体を使用することにより、H3型に対する血中中和抗体の検出が可能であると考え、グループ1中和抗体検出系と同じ方法論だけでなく、使用抗体を別の方法で検出する系を構築する方向でもいくつか検討を行った。最終的には、新たに抗体作製の必要性が生じ、タグを導入したヒトIgG型抗体を効率良く発現・精製させることのできる実験系の選定を行った。大量の組換えタンパクを一過性に発現可能なCHO細胞による発現系を導入することにより、IgG型抗体の必要量の発現及び精製が可能となることから、それに向けて発現ベクターの設計、ベクターコンストラクション等の準備を行った。このIgG型抗体の調製が完了することにより、次の実験系構築が可能になると考えている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由 H1株に対する血清中中和抗体検出法と同じ方法論により、本年度の当初に予定していたH3型に対する中和抗体検出法を検討していたが、一番最初の段階の抗体ラベリングで問題が発生し、別方向からのアプローチが必要となった。様々な市販試薬等を検討し、できるだけ安価で簡便かつ迅速に抗体のラベリングが行える試薬を検討したものの、抗原への結合活性が消失し、本研究で最も重要である抗体機能に重大な阻害を与えたり、目的に合致する市販キットがない、などという状況となった。そのため、哺乳類細胞発現系によるIgG型抗体の調製法を導入し、人工遺伝子合成により抗体遺伝子にタグを挿入するというベクター設計及びそのコンストラクション段階から開始せざるを得ない状況となった。それに伴い、本年度では抗体の調製が間に合わず、その結果検出系の条件検討まで行うことができず、来年度にずれ込んだことにより研究が遅れることとなった。
今後の研究の推進方策	本年度の検討結果よりIgG型の抗体作製及び調製が必須となり、その実験系の準備を行ってきた。来年度までの研究期間延長により本年度の研究変更を遂行することができるようになったため、CHO細胞組換えタンパク発現系による抗体作製、調製を順次進めたのち、その抗体を用いてH3株に対する血清中中和抗体検出法をH1株と同じ競合ELISA法を基に構築し、実際に血清中の中和抗体検出の有無を検討する。さらに、検出法検討時に使用したウイルス株だけでなく、それ以外の複数のA型H1株及びH3株使用時の中和抗体検出を目指し、他のアッセイ系との比較で本検出法の可能性を検討する。
次年度使用額が生じた理由	本年度の研究計画変更に伴い、当初予定していた実験が実施できなかった結果、計画とは異なる予算執行内容となった。また、本学の入札制度による努力により、使用費用が最小限に抑えられたことも大きな理由である。次年度においては、本年度の計画修正の後、実施予定としていた実験を行う予定であり、その実験に必要な試薬及び消耗品の購入に使用する計画である。