| 研究課題/領域番号 |
17K10043
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
梶原 直樹 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 主任研究員 (70453917)
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| 研究分担者 |
芝崎 太 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, プロジェクトリーダー (90300954)
大保木 啓介 公益財団法人東京都医学総合研究所, 病院等連携研究センター, 副参事研究員 (80415108) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | インフルエンザ / H5N1 / ヘマグルチニン / シアル酸 / 感染 |
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| 研究実績の概要 |
これまでの研究で、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスはシアル酸欠損細胞にも感染可能なことを見出し、その分子機構を解明すべく、新規受容体の同定に取り組んできた。前年度、3種類の受容体候補分子の機能検証実験を行ったが、それら分子の関与は否定的であった。
そこで、当該年度は、まず、ハプロイド（HAP1）細胞とジーントラップ法を用いて、新たに受容体の候補を選別した。具体的には、HAP1細胞にジーントラップ用のレトロウイルスを感染させ、ランダムに遺伝子が破壊された細胞集団を作製した。セルソーターを用いて、細胞侵入能が抑制された細胞群を濃縮し、RACE法により挿入遺伝子の位置を探索した。その結果、受容体候補分子として、Frizzled class receptor 5（FZD5）を抽出した。次に、FZD5を含むFZDファミリーの過剰発現細胞を樹立し、前年度と同様に機能的な検証を行ったが、細胞への侵入能に顕著な影響は認められず、新規受容体を見出すことができなかった。シアル酸非依存的な感染経路における受容体の同定が本研究の最重要課題であるため、再度、受容体のスクリーニングを実施している。
また、当該年度はH5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（HA）を発現する組み換えウイルス及び変異型ウイルスを作製した。前述のHaploid genetic screeningに加えて、免疫沈降法によりHAタンパク質と相互作用する分子の選別も進めている。具体的には、作製した組換えウイルスを処置した細胞を可溶化し、磁性ビーズを用いて結合タンパク質を抽出する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前年度に引き続き、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスのシアル酸非依存的な感染経路の分子機構を解明すべく、受容体の同定に取り組んだ。新たな受容体候補分子（FZD5）を見出したが、検証実験により受容体候補分子の関与が否定的となったため、新規受容体の同定には至らなかった。受容体候補分子のさらなる探索が必要となり、計画していた相互作用実験などを行うことができなかったため、「やや遅れている」と評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
再度、Haploid genetic screening を用いて、受容体の候補を選別する。候補分子のノックアウトまたは過剰発現細胞を作製し、機能的検証を行い、新規受容体を同定する。また、免疫沈降法により、組み換えウイルス及びHAタンパク質と相互作用する分子の選別も実施する。シアル酸非依存的な感染時のシグナル伝達経路について解析し、各種シグナル伝達分子の活性化状態をWestern blot、RNAi、特異的阻害剤などを用いて検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
現在までの進捗状況に記載した通り、新規受容体の同定が難航しており、本年度に予定していた実験及び解析を計画通り実施できなかったため、次年度使用額が発生した。
生じた次年度使用額については、主として交付申請書に記載の通りであり、未解決の研究課題のために使用する。具体的には、分子生物学実験試薬、細胞培養試薬、抗体等の一般試薬などの物品費、学会参加や出張のための旅費、論文投稿掲載料として使用する予定である。
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