| 研究課題/領域番号 |
17K10063
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
森島 正恵 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (00241068)
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| 研究分担者 |
森川 俊一 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (70339000) [辞退]
北原 秀治 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (40510235)
清水 一彦 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (90385394)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 遺伝・先天性疾患 / 遺伝子改変マウス / 細胞系譜 / 心血管発生 / 肺発生 |
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| 研究実績の概要 |
フォークヘッド転写因子の一つであるFoxc2 遺伝子はリンパ浮腫を伴う疾患の原因遺伝子候補として報告されている。我々はFoxc2ノックアウト(KO)マウスの心大血管奇形および肺成熟異常との関連性について解析を行い、本遺伝子欠失マウスの肺の発生過程において肺胞上皮の分化の異常とリンパ管形成の異常を呈すること、および器官形成期における肺間葉系細胞でのLef1遺伝子発現が有意に低下することを見出し報告した。しかしながら、Foxc2遺伝子は発生過程のほぼ全ての間葉系細胞で発現するため、従来のCreノックインマウスでは細胞系譜解析、および時期特異性の情報を得ることが困難である。このため、Tamoxifen（TAM) 誘導性Foxc2－Cre （Foxc2-CreERT2）マウスの分与を受け解析する運びとなっていた。搬入から本系の解析用個体が産出されるまで、本年度は、解析手技の確立と血管およびリンパ管系の形態の確認を進めていたが、Foxc2 KOマウスを用いて免疫染色法を用いて解析中、Foxc2+/－ 成獣において眼球の脈絡膜毛細血管板の血管の形態が正常と異なり、周皮細胞の分布数が多いことを見出した。Foxc2－/－胎仔（生後致死）については、大血管中膜層平滑筋の分布異常を想定していたが、この結果から、Foxc2+/－の成獣も含めた血管系の詳細な形態確認が必要と考えられ、解析を進めることとした。また、当初計画していた関連遺伝子の発現量の比較解析においても、今後はFoxc2+/－を含めた系の解析を計画している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、①Foxc2-CreERT2マウスの分与後の戻し交配を行うなど繁殖コロニーの確立と、Tamoxifen投与ステージにおける系統差の確認と手技の確立、②Foxc2 KOマウスを用いた免疫染色法、in situ hybridization等の手法による大血管および肺の発生過程における関連遺伝子の発現の比較を計画していた。しかし、Foxc2-CreERT2マウスの搬入の遅延（先方施設の腸管内原虫汚染により個体での搬入が不可能となったため)、およびマウス画像解析担当者急逝による研究分担者の交代などがあり、実験に①については遅延をきたしている。なお、Foxc2-CreERT２；R26R-LacZマウスについては、2018年4月19日に凍結胚として本学搬入済みである。また②については、Foxc2 KOマウスの血管系の形態確認に当たり、Foxc2＋間葉細胞が発生過程において視覚原基周囲に遊走することから、眼球の脈絡膜毛細血管での形態特徴を代用できるか試行したところ、Foxc2欠失(Foxc2-/-)胎仔では眼球内血管の発達が悪く、一方、成獣においてもFoxc2+/－個体において、脈絡膜毛細血管板の周皮細胞の分布増加を見出している。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の予定に従い、
①Foxc2-CreERT２；R26R-LacZマウス凍結胚は5月中に起こし、個体判別後、継代コロニーを作成、TAMに対する系統差の有無、投与ステージについて確認、手技を確立する。②免疫染色法等によるFoxc2 KO マウスの血管・リンパ管系の形態、とくに咽頭弓器官の分化・リモデリングと関連づけて解析。 さらに、肺発生を中心に、Foxc2 遺伝子の影響を調べる目的で、③器官形成期におけるLef1 関連遺伝子（canonical Wnt signaling)の発現動態と発現部位を、前者はqPCR、後者は免疫染色法を用いて解析。
①－③の画像解析手技についても試行し(分担者北原が担当）、Foxc2+細胞の細胞系譜とクローン解析にむけて必要データを収集する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、Foxc2-CreERT2マウスを個体で搬入予定だったので、先方施設での個体生産までに日にちを要した。当該年度末の搬入予定となった時点で、先方施設の腸管内原虫汚染が判明、2018年3月以降の凍結胚での搬入となった。また、当初、レポーターマウスのR26R-LacZマウスの購入を予算に組み込んでいたが、先方で凍結保存した系がFoxc2-CreERT2; R26R-LacZ ダブルミュータント個体由来の精子を用いた受精卵から得た２細胞期胚で、個別購入の必要がなくなり、当初予定していた費用が次年度に繰り越しとなった。次年度初期に、輸送費をはじめとする繰り越し分の予算は使用予定。また、LacZのレポーターマウスのみでは、二重染色等手技的に困難が生じるため、蛍光色素を組み込んだレポーターマウスの購入などにも、費用をあてる予定である。
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