| 研究課題/領域番号 |
17K10076
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
窪田 拓生 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (40629135)
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| 研究分担者 |
道上 敏美 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 環境影響部門, 部長 (00301804)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 小児内分泌学 / 小児骨代謝学 |
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| 研究実績の概要 |
くる病は骨・軟骨石灰化障害を特徴とし、その原因としてはビタミンD欠乏やリン欠乏などがある。また、アルカリホスファターゼ（ALP）欠乏によっても骨のくる病様変化が生じる。ALPの役割は、石灰化抑制物質であるピロリン酸を分解し、石灰化局所でリンを産生することと考えられているが、その局所におけるリン産生の意義は不明である。また、くる病における血清ALP値増加の意義については明らかではなく、くる病の治療過程に見られる血清ALP値の低下は骨石灰化局所へのリンの供給不足を引き起こしている可能性がある。そこで、低リン血症性くる病をモデルとして、骨の石灰化におけるALPによる局所でのリン産生の意義を明らかにし、骨石灰化障害に対する新たな治療法の開発につなげることを目的とする。
骨芽細胞株SaOS2を用いた石灰化誘導実験において、アリザリンレッド染色によって石灰化の時期をまず検討した。培養3週目から明らかな石灰化を確認した。次に、qPCRによって、骨芽細胞分化マーカーの変化を検討した。ALP、COL1A1、OCNは培養2週目から発現上昇を認めた。また、ゲノム編集技術の一つであるTALENを用いて、ALPをコードするALPL遺伝子の改変を行った。その結果、低石灰化、低ALP発現を示す低ホスファターゼ症患者由来の細胞のALP発現が増加し、石灰化が改善した。さらに、低リン血症性くる病患者において、リン代謝に重要なホルモンである線維芽細胞増殖因子23（FGF23）の血清濃度を測定したところ、ビタミンD欠乏を併存していない患者において、血清25水酸化ビタミンD濃度と血清FGF23濃度は負の相関を認めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
ピロリン酸濃度の測定が容易ではなく、ピロリン酸濃度の測定が実施できていない。そのため、石灰化におけるピロリン酸の影響を最小にするために、培養液のピロリン酸濃度を一定にするためのピロリン酸の添加ができていない。また、ALP発現のノックダウンができていないため、ALP発現低下による局所のリン濃度の変化、石灰化が検討できていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
ピロリン酸濃度測定の条件を詳細に検討し、ピロリン酸濃度を測定する。ALPの阻害薬であるlevamisoleの添加実験を行い、ALP発現低下による局所のリン濃度の変化、石灰化、遺伝子発現変化を検討する。さらに、siRNAを用いて特異的にALP発現を低下させ、局所のリン濃度の変化、ピロリン酸濃度の変化、石灰化、遺伝子発現変化を検討し、ALPの影響を検討する。一方、ALP発現ベクターは研究分担者より既に供与済みである。ALPの発現を増加させることによって、局所のリン濃度の変化、ピロリン酸濃度の変化、石灰化の促進の有無、遺伝子発現変化を検討する。遺伝子発現は骨芽細胞分化マーカー、ピロリン酸代謝に関わるNPP1, ANKに加えて、ALPが関与しているPurinergic signaling関連遺伝子の発現も検討する。
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