| 研究課題/領域番号 |
17K10086
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| 研究機関 | 愛知医科大学 |
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研究代表者 |
倉橋 宏和 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30621817)
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| 研究分担者 |
垣田 博樹 愛知医科大学, 医学部, 講師 (40528949)
奥村 彰久 愛知医科大学, 医学部, 教授 (60303624)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ミクログリア / サイトカイン / 低酸素 |
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| 研究実績の概要 |
小児の急性脳炎・脳症は死亡・後障害を約3分の1に認める重篤な転帰をとり、現状ではエビデンスが確立した治療法がない。一方、グリアは脳内微小環境の恒常性維持に関与し、その機能異常は中枢神経疾患に関与しうるが、従来の急性脳炎・脳症研究はニューロンの障害を対象としたものがほとんどで、グリアに着目した研究は乏しい。我々は以前から、新生児の低酸素性虚血性脳症などにおいてグリアに着目した研究成果を挙げており、急性脳炎・脳症においてもその知見を生かすことができる。急性脳炎・脳症におけるグリアの役割を明らかにすることは新規治療の開発につながると考えられる。そこで我々は急性脳炎・脳症におけるグリア機能異常の機序とニューロンへの影響、グリアを対象とした新規治療の開発をこの研究の目的とした。まず、ラットの脳からミクログリアを分離培養し、LPS投与と低酸素・低糖濃度環境刺激を単独または組み合わせて負荷することに対するミクログリアの反応を観察した。上記の刺激ごとに、炎症性サイトカインTNFα、IL-6、IL-1βおよび一酸化窒素合成酵素（iNOS）を測定した。iNOSは低酸素や虚血により発現が誘導される酵素で、活性酸素による神経障害に関与している。その結果、LPS刺激では炎症性サイトカインとiNOSの上昇を認めたが、低酸素・低糖濃度刺激のみではiNOSのみ上昇し炎症性サイトカインの上昇を認めなかった。LPS及び低酸素・低糖濃度環境を組み合わせた場合は、iNOSがより高値となり、炎症性サイトカインは上昇するもののLPS単独刺激ほどは上昇しなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
計画に沿って培養ミクログリアを用いた実験系で、サイトカインや環境温変化などの各種刺激による変化の測定を行った。今年度はLPS刺激、低酸素・低糖濃度刺激についての解析を行った。その他の高環境温負荷やサイトカイン刺激についても同様の実験系を用いて行えるよう体制を整えている。また、急性脳炎・脳症の遺伝学的背景の解明のため、急性脳症症例の遺伝子解析も進めている。我々は、可逆性脳梁膨大部病変を有する軽症脳炎・脳症（MERS）の家族例2家系において、MYRF遺伝子に常染色体優性遺伝形式でのミスセンス変異を同定した。MYRFはミエリン関連遺伝子の発現に関与しており、ヒトでの疾患関連の報告は初である。急性脳症にとってもミエリン関連遺伝子の関与は初であり、急性脳症に関与する多様な病態の解明についての重要な手がかりである。
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| 今後の研究の推進方策 |
ミクログリアを用いた実験は、上記に加えてHMGB1などの自然免疫刺激物質刺激なども行って、その変化を解析する予定である。それにより、急性脳症の病態により近い実験モデルを選択できると考える。また、変化の指標として、サイトカイン以外にも、興奮性アミノ酸・酸化ストレスマーカー（8－OHDG）についても測定しミクログリアの多様な反応を解析する。サイトカイン・ケモカインはタンパク質多項目同時測定システム・マルチプレックスアッセイシステム（Merick Millipore 社）にて網羅的に測定する。8-OHDGの測定は市販のキットを用いて測定する。NOxはGriess反応、興奮性アミノ酸はウエスタンブロット法で測定する。また、それぞれのケミカルメディエーター遺伝子の発現を、定量的PCRを用いて解析する。高環境温＋サイトカイン負荷後に、実際の低体温療法で用いられている34℃、および脳平温療法で用いられている36℃の環境で72時間維持し、各種ケミカルパラメータの発現の変化を経時的に評価する。ミクログリアの活性化については形態変化およびマイクロビーズを使った貪食能を指標にして解析する。オリゴデンドロサイトについては、ミエリン形成タンパクの発現に注目して解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
細胞分離培養およびサイトカイン測定に用いた費用が予定を下回ったため、次年度使用額が生じた。次年度以降の計画では細胞分離培養、サイトカイン測定が種類・数量ともに増加するため次年度使用額が必要で、過不足なく使用する予定である。
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