次世代シーケンサーを応用した小児重症ウイルス感染症の診断

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K10107
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 川田 潤一 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (20532831)
• 研究分担者: 伊藤 嘉規 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (20373491)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 次世代シーケンサー / ウイルス / 劇症肝炎

研究実績の概要

既知のウイルス感染症患者より採取された血清からDNAおよびRNAの抽出し、DNA、RNAライブラリーを作成した。DNAライブラリーはNextera XT (illumina)を使用した。RNAライブラリーはOvation RNA-Seq (NuGen)、ScriptSeq (illumina)、SMARTer Strand RNA-Seq (Takara Bio)の3つのキットで、C型肝炎ウイルスを含んだ血清を用いて、ウイルスRNAの検出感度の比較を行った。比較検討した3つのキットの中では、Ovation RNA-Seq System が、最も高感度でウイルス由来のRNAを検出できたため、以後の解析は、このキットを用いた。DNAウイルスについては。Nextera XTでウイルス由来核酸が高感度で検出されることを確認した。
平成29年度は、劇症肝炎の臨床検体を解析した。小児の劇症肝炎20症例の血清からDNAおよびRNAライブラリーを作成し、次世代シーケンサー(HiSeq 2500) により1検体あたり約1500万リードの判読を行った。得られた結果をメタゲノム情報解析パイプライン（MePIC）により解析し、国際データベースに登録されている既知の全てのウイルスの配列の有無を検討した。パイプラインでウイルス由来のリードの存在が示唆された検体に関してはCLC workbench (CLC bio)を用いて、各ウイルス配列へのマッピングや配列相同性を確認した。20症例中、7症例において何らかのウイルス由来の配列の存在が示唆された。非特異的な配列等と考えられるものを除くと、3例で有意なウイルス由来配列の存在が確認された（TTウイルス2例、アデノ随伴ウイルス1例）。しかしならが、これらのウイルスの病原性については未知の部分が多く、劇症肝炎との関連については、さらなる検討が必要である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

(1) 次世代シーケンサーによる臨床検体からのウイルス検出系の構築
既知のウイルス感染症患者より採取された血清からDNAおよびRNAの抽出し、DNA、RNAライブラリーを作成した。DNAライブラリーはNextera XT (illumina)を、RNAライブラリーはOvation RNA-Seq (NuGen)を用いることで、ウイルス由来核酸が高感度で検出されることが可能であった。血清検体は、DNAやRNAがごく少量しか含まれていないため、ライブラリーを作成するために十分な量が得られていないことが危惧された。特にRNAライブラリーの作成においては、抽出されたRNAが必要量に満たないため、解析に必要なライブラリーを作成が困難であり、ウイルスRNAの検出高率も不十分であった。しかしながら、Ovation RNA-Seqは、ごく少量のRNAからも解析に必要なRNAライブラリーを作成することが可能であり、1000万リード程度の解析を行うことで、一般に用いられる定量PCRとほぼ同程度の感度で検出することが可能であった。さらに、ウイルス配列の詳細についもて解析することが可能であり、次世代シーケンサーによる臨床検体からのウイルス検出は、非常に有用な手法であることが示唆された。
（2）病原ウイルス不明の劇症肝炎からのウイルス検出
平成29年度は、小児の劇症肝炎20症例の解析を行い、3例で有意なウイルス由来配列の存在が確認された（TTウイルス2例、アデノ随伴ウイルス1例）。これらの症例は、各種検査を行ったにもかかわらず原因は特定できなかった症例であり、次世代シーケンサーによるウイルス核酸の検出が、診断に有用である可能性が示唆された。しかしならが、今回の解析で特定されたウイルスの病原性については未知の部分が多く、疾患との関連については、さらなる検討が必要である。

今後の研究の推進方策

（1）病原ウイルス不明の臨床検体からのウイルス検出
前年度に引き続き、次世代シーケンサーによるウイルス検出を行う。平成30年度は、急性心筋炎および、免疫不全宿主における重症感染症患者の臨床検体を解析する予定であり、各疾患群とも20症例程度を予定している。また、血清検体に加えて、生検組織や肺胞洗浄液の検体など用いた解析も検討しており、これらの臨床検体を用いることで、より疾患と関連した病原ウイルスの検出が期待される。
さらに、メタゲノム解析で既知の病原ウイルスが検出されなかった症例を中心に、 de novo アセンブリ解析をCLC workbenchや、Virus TAP (国立感染症研究所)用いて行う。 de novo アセンブリ解析は、断片化された核酸の塩基配列を再構築する手法である。再構築された配列と、既知のウイルスとの相同性と検証することで、何らかのウイルスの存在が疑われた場合には、より多量の解析を行うことで、新規ウイルスの全塩基配列の解読を試みる。
（2）ウイルスの病原性の検証
病原ウイルスが検出された検体に関しては、次世代シーケンサーの判読リード数を増やして再解析を行うことで、ウイルスの分子疫学や病原性に関連した遺伝子の解析等を行う。また、肝生検などで患者の病変組織が得られている場合には、組織を用いて次世代シーケンサーによる解析を行うとともに、ウイルスの免疫染色やPCR法を行うことで、組織への感染の有無を評価し、さらに病理学的な検証を行う。さらには、末梢血や組織の検体を用いて、ウイルス感染時に誘導される免疫応答についても評価する予定である。これらの解析を通じて、ウイルスと臨床病態との関連についての検証を試みる。

次年度使用額が生じた理由

次世代シーケンサーによる病原ウイルスの解析のために、MiSeq Reagent Nano Kit2 を購入する必要があったが、29年度の経費が不足しており、次年度に購入し解析をすすめる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Survey of rotavirus-associated severe complications in Aichi Prefecture (2018)
  • 著者名/発表者名: Hattori, F. Kawamura, Y. Kawada, J. I. Kojima, S. Natsume, J. Ito, K. Saito, S. Kitagawa, Y. Okumura, A. Yoshikawa, T.
  • 雑誌名: Pediatr Int 巻: 60 ページ: 259-263
  • DOI: 10.1111/ped.13506
  • 査読あり
• [雑誌論文] Antitumor effects of duvelisib on Epstein-Barr virus-associated lymphoma cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Kawada, J. Ando, S. Torii, Y. Watanabe, T. Sato, Y. Ito, Y. Kimura, H.
  • 雑誌名: Cancer Med 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1002/cam4.1311
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Comprehensive detection of pathogens in immunocompromised children with bloodstream infections by next-generation sequencing (2018)
  • 著者名/発表者名: Horiba, K. Kawada, J. Okuno, Y. Tetsuka, N. Suzuki, T. Ando, S. Kamiya, Y. Torii, Y. Yagi, T. Takahashi, Y. Ito, Y.
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 8 ページ: 3784
  • DOI: 10.1038/s41598-018-22133-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Treatment with silver nitrate versus topical steroid treatment for umbilical granuloma: A non-inferiority randomized control trial (2018)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, C. Sato, Y. Suzuki, C. Mano, A. Tashiro, A. Niwa, T. Hamazaki, S. Tanahashi, Y. Suzumura, M. Hayano, S. Hayakawa, M. Tsuji, T. Hoshino, S. Sugiyama, Y. Kidokoro, H. Kawada, J. Muramatsu, H. Hirakawa, A. Ando, M. Natsume, J. Kojima, S.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 13 ページ: e0192688
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0192688
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Comprehensive detection of viruses in pediatric patients with acute liver failure using next-generation sequencing (2017)
  • 著者名/発表者名: Suzuki, T. Kawada, J. Okuno, Y. Hayano, S. Horiba, K. Torii, Y. Takahashi, Y. Umetsu, S. Sogo, T. Inui, A. Ito, Y.
  • 雑誌名: J Clin Virol 巻: 69 ページ: 67-72
  • DOI: 10.1016/j.jcv.2017.10.001
  • 査読あり
• [雑誌論文] Epstein-Barr virus infection-induced inflammasome activation in human monocytes (2017)
  • 著者名/発表者名: Torii, Y. Kawada, J. Murata, T. Yoshiyama, H. Kimura, H. Ito, Y.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 12 ページ: e0175053
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0175053
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Metabolome analysis reveals the association between the kynurenine pathway and human herpesvirus 6 encephalopathy in immunocompetent children (2017)
  • 著者名/発表者名: Torii, Y. Kawano, Y. Sato, H. Fujimori, T. Sasaki, K. Kawada, J. Takikawa, O. Lim, C. K. Guillemin, G. J. Ohashi, Y. Ito, Y.
  • 雑誌名: Metabolomics 巻: 13 ページ: 126
  • DOI: 10.1007/s11306-017-1268-x
  • 査読あり
• [学会発表] 次世代シーケンシングによる血流感染症の微生物ゲノム分布解析と臨床応用 (2017)
  • 著者名/発表者名: 堀場千尋、川田潤一、手塚宜行、武内俊、鈴木高子、安藤将太郎、神谷泰子、鳥居ゆか、伊藤嘉規
  • 学会等名: 第91回日本感染症学会総会
• [学会発表] 小児菌血症患者の病原菌診断における次世代シーケンサーの臨床応用 (2017)
  • 著者名/発表者名: 堀場千尋、川田潤一、手塚宜行、武内俊、鈴木高子、安藤将太郎、神谷泰子、鳥居ゆか、高橋義行、伊藤嘉規
  • 学会等名: 第120回日本小児科学会学術集会
• [学会発表] 尿路感染症、尿路奇形診断におけるMRIの有用性の検討 (2017)
  • 著者名/発表者名: 村上典寛、川田潤一、河野好彦、小島大英、加納孝真、田中亮、鈴木高子、辻健史、佐藤義朗、夏目淳
  • 学会等名: 第120回日本小児科学会学術集会
• [学会発表] 次世代シーケンサーの血流感染症における病原微生物診断への可能性 (2017)
  • 著者名/発表者名: 堀場千尋、川田潤一、奥野友介、手塚宜行、鈴木高子、鳥居ゆか、伊藤嘉規
  • 学会等名: 第５回NGS現場の会
• [学会発表] ヒト単核細胞におけるEBウイルス感染によるインフラマソーム活性の検討 (2017)
  • 著者名/発表者名: 川田潤一、鳥居ゆか、武内俊、堀場千尋、鈴木高子、村田貴之、吉山裕規、木村宏、伊藤嘉規
  • 学会等名: 第31回ヘルペスウイルス研究会
• [学会発表] ヘルペスウイルス感染症について (2017)
  • 著者名/発表者名: 川田潤一
  • 学会等名: 第18回 感染症fundamentals
  • 招待講演
• [学会発表] 次世代シーケンサーの小児血流感染症における病原微生物診断への臨床応用 (2017)
  • 著者名/発表者名: 堀場千尋、川田潤一、奥野友介、手塚宜行、武内俊、鈴木高子、鳥居ゆか、伊藤嘉規
  • 学会等名: 第11回日本ゲノム微生物学会若手の会
• [学会発表] 多彩な症状を呈した慢性活動性EBウイルス感染症の1例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 安藤将太郎、加藤徹、鈴井良輔、長井 典子、加藤 陽一、川田潤一、木村宏、伊藤嘉規
  • 学会等名: 第21回東海小児感染症研究会
• [学会発表] 胎児期の脳室拡大を契機に診断された先天性サイトメガロウイルス感染症の1例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 田中雅人、上田一仁、田中亮、呉尚治、三浦良介、浅田英之、北瀬悠磨、鈴木俊彦、立花貴史、見松はるか、伊藤美春、齊藤明子、村松友佳子、佐藤義朗、早川昌弘、夏目淳、城所博之、伊藤嘉規、川田潤一、高橋義行
  • 学会等名: 第271回日本小児科学会東海地方会
• [学会発表] Cytomegalovirus感染を伴った初期治療不応の特発性血小板減少性紫斑病の１例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 西尾洋介、河野好彦、原紳也、川田潤一、伊藤嘉規
  • 学会等名: 第49回日本小児感染症学会
• [学会発表] 慢性活動性EBウイルス感染症の病態と診療ガイドライン (2017)
  • 著者名/発表者名: 川田潤一
  • 学会等名: 第49回日本小児感染症学会
  • 招待講演
• [学会発表] 次世代シーケンサーによる小児急性肝不全・重症急性肝炎症例からの病原ウイルス検索 (2017)
  • 著者名/発表者名: 鈴木高子、川田潤一、堀場千尋、梅津守一郎、十河剛、奥村俊彦、武内俊、鳥居ゆか、乾あやの、伊藤嘉規
  • 学会等名: 第49回日本小児感染症学会
• [学会発表] 病初期のPCR検査が陰性であった単純ヘルペス脳炎の一例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 貴文、山本啓之、牧祐輝、田中雅大、岡井佑、坂口陽子、大野敦子、中田智彦、城所博之、柴田雄介、柴田元博、川田潤一、伊藤嘉規、夏目淳
  • 学会等名: 第48回小児神経学会東海地方会
• [学会発表] Inflammasome-mediated IL-1β production by Human Monocyte with primary EBV infection (2017)
  • 著者名/発表者名: Jun-ichi Kawada, Yuka Torii, Takayuki Murata, Hironori Yoshiyama, Hiroshi Kimura, Yoshihiro Ito
  • 学会等名: International Herpesvirus Workshop
• [学会発表] Comprehensive Detection of Pathogens in Immunocompromised Children with Bloodstream Infections by Next-generation Sequencing (2017)
  • 著者名/発表者名: Kazuhiro Horiba, Jun-ichi Kawada Yusuke Okuno, Nobuyuki Tetsuka, Takako Suzuki, Shotaro Ando, Yasuko Kamiya, Yuka Torii, Tetsuya Yagi, Yoshiyuki Takahashi, Yoshinori Ito
  • 学会等名: IDSA