| 研究課題/領域番号 |
17K10108
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
荒堀 仁美 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (40379186)
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| 研究分担者 |
北畠 康司 大阪大学, 医学部附属病院, 講師 (80506494)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ダウン症候群 / iPS細胞 / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
ダウン症候群では21番染色体上にコードされる遺伝子の量効果（gene dosage effects）によってさまざまな合併症が引き起こされる。しかし病態責任遺伝子がどこにあるのかは分からない。そこで本研究においては、ゲノム編集技術をもちいて、ヒトXIST遺伝子をテトラサイクリン誘導システム下に制御することのできる21トリソミー部分不活化iPS細胞ライブラリーの樹立を目指す。
今年度はまずヒトiPS細胞に導入するためのXISTベクターの作成を行った。XISTは可逆的な発現誘導をかけるため、Tetシステムをもちいることとした。
まずTetトランスアクチベーター配列として、Tet-On 3Gコンストラクトを作成した。これはEF1aプロモーター下にTet-ON 2Gを、PGKプロモーター下にNeoをつなげたダブルプロモーター配列としたものである。つぎにTet応答因子配列として、まずEF1aプロモーター下にPuroΔTK配列がつながったものをloxP/lox5171に挟んだ挿入カセットを作成した。これは最初に21番染色体上に挿入するための挿入カセットとなる。つぎにTRE3Gプロモーター下にhuman XISTをつないだものを、やはりloxP/lox5171にはさまれたコンストラクトを作成した。
ヒトXIST cDNAについては７つのフラグメントになったものを入手し、それらをつなぎあわせることで作成した。完全長のXISTを作成するのは容易でなく、その完成に難渋したが、Gibson Assembly法をもちいることで完成することができた。
最終的には塩基配列を読み、これらの配列が正常であることを確認した。このようにしてすべてのコンストラクトを作成することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
XISTの配列は17kbと大きいため、フラグメントをつなぎ合わせることは容易ではなかったが、gibson assemblyをもちいることで乗り越えることができた。
年度内に目的のコンストラクト作成を完成させることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度はiPS細胞への導入を行う。
まずTetトランスアクチベーター配列をヒトsafe harbor領域である19番染色体AASV1領域へ導入する。つぎにTet応答配列を21番染色体上に誘導する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ゲノム編集をもちいたヒトiPS細胞への遺伝子導入に多くの費用がかかるはずであったが、今年度はコンストラクトの完成のみにとどまった。来年度に使用する予定である。
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