| 研究課題/領域番号 |
17K10108
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
荒堀 仁美 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (40379186)
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| 研究分担者 |
北畠 康司 大阪大学, 医学部附属病院, 講師 (80506494)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ダウン症候群 / iPS細胞 / ゲノム編集 / 染色体異常 |
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| 研究実績の概要 |
ダウン症候群では21番染色体上にコードされる遺伝子の量効果（gene dosage effects）によってさまざまな合併症が引き起こされる。しかし病態責任遺伝子がどこにあるのかは分からない。そこで本研究においては、ゲノム編集技術をもちいて、ヒトXIST遺伝子をテトラサイクリン誘導システム下に制御することのできる21トリソミー部分不活化iPS細胞ライブラリーの樹立を目指す。この方法は以下の通りとなる。
【Tet トランスアクチベーター】Tet-On 3G コンストラクトの作成 【Tet 応答因子配列】1．loxP/lox5171 挿入カセットの作成（CRISPR/Cas9） 2．XIST cDNA のクローニング、PTRE3G-XIST コンストラクトの作成 3．PTRE3G- XIST 配列の挿入
昨年度までにヒトiPS細胞に導入するためのXISTベクターの作成と、Tet制御システムをもちいたすべてのコンストラクトを作製することができた。本年度はこれらのiPS細胞への挿入を行った。まずCRISPR/Cas9 による相同組換えを利用し、Tet-On 3G コンストラクトを19 番染色体AAVS1 領域へと挿入した。つぎに21 トリソミーiPS 細胞の21 番染色体上へloxP/lox5171 挿入カセットを導入した。さらにloxP/lox5171 を利用して挿入カセットとの交換によりPTRE3G-XIST コンストラクトの挿入を行った。
これによりすべてのiPS細胞を樹立することができた。さらに核型解析を行い、これらの核型に異常が生じていないことも確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
想定通り、ゲノム編集技術をもちいてコンストラクトをiPS細胞へと挿入することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
作製したiPS細胞に対してDox投与を行い、XISTによる遺伝子サイレンシングが起こるか確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定していた実験計画に必要な試料の調達に時間がかかり、正確な解析を行うためには十分な準備のうえ次年度に行うことが必要と思われたため。
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