| 研究課題/領域番号 |
17K10121
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
浅井 清文 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (70212462)
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| 研究分担者 |
藤田 政隆 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (10360637)
加藤 晋 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (90551250)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | アクアポリン / 血液脳関門 / アストロサイト / 蛍光タンパク / 急性脳症 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度からの研究を継続し、アストロサイトの活性化状態を検出する指標として、アクアポリン４（以下AQP4）の発現と細胞内局在を観察することを行った。AQP4の細胞内局在をリアルタイムで観察するために、蛍光タンパクとの融合タンパク質を培養細胞に遺伝子導入し発現させた。AQP4のアイソフォームにより分子の集合状態が変化することが分かっているので、AQP4-M1（1番目のメチオニンからのアイソフォーム）とAQP4-M23（23番目のメチオニンからのアイソフォーム）をベースとしたベクターを構築した。細胞質内または細胞内小胞に存在するAQP4と細胞膜上に局在するAQP4を見分けることが出来ないかと考え、M1とM23のヒトAQP4cDNAの細胞外ループに相当する部分にpH感受性で緑色を呈するpHluorinの遺伝子を挿入し、AQP4cDNAのC末端側に赤色を呈するmKate遺伝子を挿入した発現ベクターを構築した。また、比較対照として、M1とM23のAQP4cDNAのC末端側にmKateのみを挿入した発現ベクターも準備した。これらのベクターを本研究室で樹立したラットアストロサイト不死化細胞ACT-57に遺伝子導入し、導入後から96時間後までの蛍光タンパクの発現と局在を観察した。pHluorinとmKateの両者の発現を確認するとともに、pHluorinの蛍光にpH感受性があることも確認出来たことから、構築したベクターが予定通りの融合タンパクを発現していることが確認出来た。この発現系を用いて、血管内皮細胞との共培養系の研究を開始したが、十分な結果を得るまでには至らなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
令和元年度中にアストロサイトでのAQP4発現系を樹立し、血管内皮細胞との共培養系の研究を開始したものの、十分な結果を得るまでの進捗が得られなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
実験系にある程度目処が立ってきているので、現在の研究を継続し、目的とする研究データを得ることに専念したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和元年度に予定していた血管内皮細胞との共培養系の実験が予定通り進まなかったため、予定していた試薬・培養液の購入を見合わせた。
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