| 研究課題/領域番号 |
17K10128
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
荻原 建一 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (50623500)
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| 研究分担者 |
野上 恵嗣 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (50326328)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | フォン・ウィルブランド因子 / 一塩基多型 / 凝固第VIII因子 |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではフォン・ウィルブランド因子（VWF）が凝固第VIII因子（FVIII）と結合する上で重要なD'D3ドメインの機能増強を起こし得る遺伝子バリアントをin silico解析により探索し、機能増強型VWF遺伝子の存在を探る目的のもと、以下の4ステップの計画のうち、ステップ③に進んでいる。
①HEK293T細胞を用いたヒトVWF蛋白の発現モデルの確立：ヒトVWFcDNAを挿入したプラスミドを作成し培養皿内でHEK293T細胞へのトランスフェクションを実施し、VWF蛋白を発現し、その機能（コラーゲン結合能、FVIII結合能）を確認した。
②D'D3ドメインの多型/変異候補の探索と絞り込み：VWDデータベース（http://www.hemobase.com/vwf/VWF_Database/ISTH_Database/ISTH_Database.html）およびVWFバリアントデータベース(http://evs.gs.washington.edu/EVS/, Johnsen Blood 2016)から、VWFのD'D3領域（S764-P1247）のtype2N VWD変異29箇所とその周辺の一塩基多型72箇所を抽出した。これらの配列から予測される蛋白構造、RNA構造、スプライシング部位を各種in silico解析ツールを用いて探索し、機能増強可能性のある10-12のバリアント候補を絞り込んだ。
③絞り込んだ候補多型/変異のVWF蛋白の発現と解析：バリアントのうち、2つのVWFバリアント蛋白の発現を実施し、そのVWF機能（コラーゲン結合能、FVIII結合能）を解析中である。
④VWFノックアウトマウスを用いたヒトVWFcDNAのin vivo発現実験:VWF発現量、FVIII結合能の変化量が多かった多型/変異を絞り込み、VWFノックアウトマウスへの遺伝子導入を予定している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度にVWF蛋白発現工程の条件調整が必要であったため、①のステップに遅れが生じ、③のバリアント蛋白発現のステップに進むことができなかった。現在は解決した。
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| 今後の研究の推進方策 |
バリアント蛋白の発現種類をさらに増やしてその機能解析を終了し、最終ステップであるVWFノックアウトマウスを用いた実験を実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
消耗品の費用が予定より少額であったため。次年度で当初計画で必要な物品へ使用予定である。
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