| 研究課題/領域番号 |
17K10128
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
荻原 建一 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (50623500)
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| 研究分担者 |
野上 恵嗣 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (50326328)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | フォン・ウィルブランド因子 / 一塩基多型 / 第VIII因子 |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではフォン・ウィルブランド因子（VWF）が凝固第VIII因子（FVIII）と結合する上で重要なD'D3ドメインの機能増強を起こし得る遺伝子バリアントをin silico解析により探索し、機能増強型VWF遺伝子の存在を探る目的のもと、以下の4ステップの計画のうち、ステップ③に進んでいる。
①HEK293T細胞を用いたヒトVWF蛋白の発現モデルの確立：ヒトVWFcDNAを挿入したプラスミドを作成し培養皿内でHEK293T細胞へのトランスフェクションを実施し、VWF蛋白を発現し、その機能（コラーゲン結合能、FVIII結合能）を確認した。
②D'D3ドメインの多型/変異候補の探索と絞り込み：VWDデータベースおよびVWFバリアントデータベースから、VWFのD'D3領域（S764-P1247）のtype2N VWD変異とその周辺の一塩基多型を抽出し、これらの配列から予測される蛋白構造、RNA構造、スプライシング部位を各種in silico解析ツールを用いて探索し、機能増強可能性バリアント候補を絞り込んだ。
③絞り込んだ候補多型/変異のVWF蛋白の発現と解析：バリアントのうち、複数のVWFバリアント蛋白の発現を実施し、そのVWF機能（コラーゲン結合能、FVIII結合能）を解析した。FVIII結合能増強バリアントは同定されておらず、ステップ②を再実施したうえで、機能解析を継続している。
④VWFノックアウトマウスを用いたヒトVWFcDNAのin vivo発現実験:VWF発現量、FVIII結合能の変化量が多かった多型/変異を絞り込み、VWFノックアウトマウスへの遺伝子導入を予定している。
ステップ④に進むに至っておらず、研究期間を延長している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
初年度にVWF蛋白発現工程の条件調整が必要であったが、2020年度には、ベクターのHEK細胞への導入にpiggyBacトランスポゾンを用いることで、変異VWFの安定的発現に成功した。しかし、機能解析において機能増強を確認するに至っていなかったため、②のD'D3ドメインの多型/変異候補の探索と絞り込みを再度見直し、機能増強変異の候補を再検討し、候補変異を増やして発現VWFバリアントのFVIII結合能試験を繰り返した。野生株とType2N変異株（T789P）の結合能は想定どおりであるが、野生株を上回る結合能を示す変異株の同定に至っていない。VWF機能解析（コラーゲン結合能、FVIII結合能）方法の見直しも行い、再現性よく解析できていることを確認した。新型コロナ対策で研究に十分な時間を割けなかったことも一因である。
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| 今後の研究の推進方策 |
機能増強可能性のあるバリアント候補を同定し、最終ステップであるVWFノックアウトマウスを用いた実験につなげたい。機能増強バリアントが見出せなかった場合でも、これまでの成果をまとめて発表する。
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