小児急性骨髄性白血病の統合的遺伝子解析と臨床への応用

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K10130
• 研究機関: 群馬県衛生環境研究所
• 研究代表者: 林 泰秀 群馬県衛生環境研究所, 研究企画係, 研究員 (30238133)
• 研究分担者: 大久保 淳 北海道大学, 大学病院, 医員 (30568754) [辞退] ; 朴 明子 群馬県衛生環境研究所, 研究企画係, 研究員 (50450375) ; 外松 学 群馬県衛生環境研究所, 研究企画係, 研究員 (70251113)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 小児血液学 / 遺伝子 / マイクロアレイ / トランスクリプトーム / メチル化アレイ / RAS経路 / ITD

研究実績の概要

小児急性骨髄性白血病(AML)予後不良な疾患である。近年の次世代シーケンサーの進歩により、我々はJPLSG-AML-05症例の検体を用いて全エクソン解析、トランスクリプトーム解析、網羅的メチル化解析等を行い、臨床像との関連を解析してきた。
今年度はRAS経路の遺伝子異常を有するAMLの臨床的特徴を明らかにする目的で、PTPN11(exons 2-4,13 CBL(eons 8-9)および N, K-RAS (Exons 1-2)遺伝子について解析を行った。PTPN11は21例に、CBLは８例に、NRASは49例に、KRASは13例に変異がみられ、全体の24.7％にRAS経路遺伝子の異常を認め、これらは相互排他的であった。PTPN11、NRAS変異例では予後との関連が認められ、特にPTPN11陽性例は５年EFSでは著明な有意差がみられた。CBL変異陽性例と陰性例では予後に有意差は認めなかったが、全陽性8例中非CBF群の3例はいずれも再発を認めた。
KIT D816(exon17)変異はJPLSG t(8;21)-AMLにおいて予後不良因子として知られている。我々は再発時にexon 11のInternal tandem duplication (ITD)を認めた症例を経験したので、さらにKIT-ITDについても検討を行った。KIT-ITDは本邦での報告はなく、海外からの報告数も少なく、いまだに臨床像も明らかではなく、予後との関連は不明であり、さらなる症例の蓄積が必要と考えられた。我々は本邦の小児AMLと成人AML 症例、特にt(8;21) を有する症例を集めて検討を行い、さらに1例の症例を見出した。今後さらに症例を増やしてKIT-ITD の臨床像を明らかにする予定である。AML-05 369例のtarget sequencing とメチル化解析も行っていてまとめている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

RAS経路の遺伝子異常を有するAMLの臨床的特徴を明らかにする目的で、PTPN11(exons 2-4,13 CBL(eons 8-9)および N, K-RAS (Exons 1-2)遺伝子について解析を行いPTPN11は21例に、CBLは８例に、NRASは49例に、KRASは13例に変異がみられ、全体の24.7％にRAS経路遺伝子の異常を認め、これらは相互排他的であった。PTPN11、NRAS変異例では予後との関連が認められ、特にPTPN11陽性例は５年EFSでは著明な有意差がみられた。CBL変異陽性例と陰性例では予後に有意差は認めなかったが、全陽性8例中非CBF群の3例はいずれも再発を認めた。
KIT D816(exon17)変異はJPLSG t(8;21)-AMLにおいて予後不良因子として知られている。我々は再発時にexon 11のInternal tandem duplication (ITD)を認めた症例を経験したので、さらにKIT-ITDについても検討を行った。KIT-ITDは本邦での報告はなく、海外からの報告数も少なく、いまだに臨床像も明らかではなく、予後との関連は不明であり、さらなる症例の蓄積が必要と考えられた。我々は本邦の小児AMLと成人AML 症例、特にt(8;21) を有する症例を集めて検討を行い、さらに1例の症例を見出した。今後さらに症例を増やしてKIT-ITD の臨床像を明らかにする予定である。AML-05の369例のtarget sequencing も行っていてまとめている。　　順調に進展しているのは、解析は京都大学細胞生物との共同研究で、この施設は成人も含めた多数例の解析を行っており、高精度の解析を行うことができたことが順調な原因と思われる。

今後の研究の推進方策

RAS経路とKIT-ITDの解析に加え、正常核型症例を中心に64例を抽出し、網羅的にメチル化解析よりPRDM16高発現群等これまでの分類による群に特徴的なメチル化パターンが見いだされた。また、PRDM16、HOX遺伝子群を中心に症例間でメチル化パターンの差が大きくみられた約100個の遺伝子を抽出し、個別に検討を行ったところ、多くの遺伝子で遺伝子異常とメチル化パターンに強い相関が認められた。新たに抽出されたメチル化領域は検証を行い、有用なものについては5-aza-deoxythidineによるin vitro assayも行う。また、正常核型61例を含む140例でトランスクリプトームによりRUNX1やETV6関連の融合遺伝子が新規で数例検出された。これらはAML発症に重要であると考えられ、小児AMLの発症や進展に関与する遺伝子を絞り込み、発現解析、変異解析、FISH解析などを行い、遺伝子の性状および造腫瘍性の解析を行う。さらに有用なものに関しては細胞株やマウスを用いて機能解析を行う。最終的には正常細胞に対する毒性が低く、抗腫瘍効果の高い物質に関して、分子標的薬の基盤を整備する。またAMLの病型別ゲノム変異およびエピゲノム変異の特性を明らかにすることにより、これまで困難であった分子診断技術の開発に着手し、これまでの臨床情報、全エクソン解析の結果を組み合わせ、予後解析を行い、新規予後予測因子の同定に基づくリスク別層別化も試みる。これらの遺伝子の詳細な解析を行い、これまでの遺伝子解析との結果を統合することで新たな治療層別化を試み、この結果をもとに今後の小児AML治療に抗メチル化薬やHDAC阻害剤などの新規薬剤の臨床応用についての検討を行う。

次年度使用額が生じた理由

小児AML 90例の次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析と網羅的メチル化解析を行い、小児AMLの未知の原因遺伝子をみいだし、Targetシーケンス解析による予後因子の検索と分子標的療法を開発するための分子遺伝学的基盤を構築しつつある。
昨年度は、網羅的メチル化解析の症例数が少なかったことが、次年度使用額が生じた最も大きな理由である。これはやって頂いている施設の処理能力を超えていたようで、順調に進展していた研究が少し阻害された。その結果、検証する症例数が減り、次年度の研究に先送りされてしまった。これらの症例についてはすでに検体を有しているので、今年度はそれを取り戻すべく症例数を増やし、詳細な検証も行うので昨年度の先送りされた研究費は今年度中に使う予定である。経過としては今年度の前半に可能な限りできなかった症例の次世代シーケンサーによる網羅的メチル化解析、および抽出された遺伝子を詳細に検討するため機能解析やTargetシーケンス解析による予後因子の検索を通じて分子標的療法を開発するための分子遺伝学的基盤を構築する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Clinical and molecular characteristics of MEF2D fusion-positive B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia in childhood, including a novel translocation resulting in MEF2D-HNRNPH1 gene fusion. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ohki K, Kiyokawa N, Hayashi Y, Koh K, Manabe A, Ohara A; Tokyo Children’s Cancer Study Group (TCCSG) et al.
  • 雑誌名: Haematologica. 巻: 104(1) ページ: 128-137
  • DOI: 10.3324/haematol.2017.186320.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel neuroblastoma amplified sequence (NBAS) mutations in a Japanese boy with fever-triggered recurrent acute liver failure. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ono S, Matsuda J, Watanabe E, Akaike H, Teranishi H, Miyata I, Otomo T, Sadahira Y, Mizuochi T, Kusano H, Kage M, Ueno H, Yoshida K, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Miyano S, Ogawa S, Hayashi Y, Kanegane H, Ouchi K.
  • 雑誌名: Hum Genome Var. 巻: 7;6:2 ページ: －
  • DOI: 10.1038/s41439-018-0035-5.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A germline HLTF mutation in familial MDS induces DNA damage accumulation through impaired PCNA polyubiquitination. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takaoka K, Kawazu M, Koya J, Yoshimi A, Masamoto Y, Maki H, Toya T, Kobayashi T, Nannya Y, Arai S, Ueno T, Ueno H, Suzuki K, Harada H, Manabe A, Hayashi Y, Mano H, Kurokawa M.
  • 雑誌名: Leukemia. 巻: 29 ページ: ー
  • DOI: 10.1038/s41375-019-0385-0.
  • 査読あり
• [雑誌論文] NOTCH1 pathway activating mutations and clonal evolution in pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kimura S, Seki M, Yoshida K, Shiraishi Y, Akiyama M, Koh K, Imamura T, Manabe A, Hayashi Y, Kobayashi M, Oka A, Miyano S, Ogawa S, Takita J.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 110(2) ページ: 784-794
  • DOI: 10.1111/cas.13859.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Clinical and biological features of paediatric acute myeloid leukaemia (AML) with primary induction failure in the Japanese Paediatric Leukaemia/Lymphoma Study Group AML-05 study. (2019)
  • 著者名/発表者名: Miyamura T, Moritake H, Nakayama H, Tanaka S, Tomizawa D, Shiba N, Saito AM, Tawa A, Shimada A, Iwamoto S, Hayashi Y, Koike T, Horibe K, Manabe A, Mizutani S, Taga T, Adachi S.
  • 雑誌名: Br J Haematol. 巻: 19 ページ: ー
  • DOI: 10.1111/bjh.15799.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Risk-stratified therapy for children with FLT3-ITD-positive acute myeloid leukemia: results from the JPLSG AML-05 study. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shimada A, Iijima-Yamashita Y, Tawa A, Tomizawa D, Yamada M, Norio S, Watanabe T, Taga T, Iwamoto S, Terui K, Moritake H, Kinoshita A, Takahashi H, Nakayama H, Koh K, Goto H, Kosaka Y, Saito AM, Kiyokawa N, Horibe K, Hara Y, Oki K, Hayashi Y, Tanaka S, Adachi S.
  • 雑誌名: Int J Hematol. 巻: 107(5) ページ: 586-595
  • DOI: 10.1007/s12185-017-2395-x.
  • 査読あり
• [雑誌論文] RUNX1 mutations in pediatric acute myeloid leukemia are associated with distinct genetic features and an inferior prognosis. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamato G, Shiba N, Yoshida K, Hara Y, Shiraishi Y, Ohki K, Okubo J, Park MJ, Sotomatsu M, Arakawa H, Kiyokawa N, Tomizawa D, Adachi S, Taga T, Horibe K, Miyano S, Ogawa S, Hayashi Y.
  • 雑誌名: Blood. 巻: 17;131(20) ページ: 2266-2270
  • DOI: 10.1182/blood-2017-11-814442.
  • 査読あり
• [雑誌論文] PPP2R1A regulated by PAX3/FOXO1 fusion contributes to the acquisition of aggressive behavior in PAX3/FOXO1-positive alveolar rhabdomyosarcoma. (2018)
  • 著者名/発表者名: Akaike K, Suehara Y, Kohsaka S, Hayashi T, Tanabe Y, Kazuno S, Mukaihara K, Toda-Ishii M, Kurihara T, Kim Y, Okubo T, Hayashi Y, Takamochi K, Takahashi F, Kaneko K, Ladanyi M, Saito T.
  • 雑誌名: Oncotarget. 巻: 18;9(38) ページ: 25206-25215
  • DOI: 10.18632/oncotarget.25392.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Recurrent CCND3 mutations in MLL-rearranged acute myeloid leukemia. (2018)
  • 著者名/発表者名: 4.Matsuo H, Hayashi Y, Mano H, Miyano S, Kamikubo Y, Ogawa S, Adachi S et al.
  • 雑誌名: Blood Adv. 巻: 13;2(21) ページ: 2879-2889
  • DOI: 10.1182/bloodadvances.
  • 査読あり
• [学会発表] ダウン症候群児の急性リンパ性白血病における包括的なゲノム解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 久保田 泰央, 瓜生 久美子, 伊東 竜也, 河合 智子, 関 正史, 磯部 知弥, 土岐 力, 吉田 健一, 片岡 圭祐, 大木 健太郎, 清河 信敬, 宮野 悟, 岡 明, 林 泰秀, 小川 誠司, 佐藤 篤, 照井 君典, 秦 健一郎, 伊藤 悦郎, 滝田 順子
  • 学会等名: 第121回日本小児科学会学術集会
• [学会発表] 幼弱T細胞性急性リンパ性白血病の予後因子の検討(Prognostic analysis of immature T-cell acute lymphoblastic leukemia) (2018)
  • 著者名/発表者名: 木村 俊介, 関 正史, 吉田 健一, 上野 浩生, 大木 健太郎, 小林 良二, 出口 隆生, 橋井 佳子, 今村 俊彦, 佐藤 篤, 清河 信敬, 小林 正夫, 岡 明, 林 泰秀, 真部 淳, 小原 明, 堀部 敬三, 宮野 悟, 小川 誠司, 滝田 順子
  • 学会等名: 第121回日本小児科学会学術集会
• [学会発表] ダウン症候群時の急性リンパ性白血病におけるPh-likeの同定(Ph-like signature in acute lymphoblastic leukemia of Down syndrome) (2018)
  • 著者名/発表者名: 久保田 泰央, 瓜生 久美子, 伊東 竜也, 河合 智子, 関 正史, 磯部 知弥, 土岐 力, 吉田 健一, 片岡 圭亮, 白石 友一, 千葉 健一, 田中 洋子, 大木 健太郎, 清河 信敬, 宮野 悟, 岡 明, 林 泰秀, 小川 誠司, 照井 君典, 佐藤 篤, 秦 健一郎, 伊藤 悦朗, 滝田 順子
  • 学会等名: 第80回日本血液学会学術集会
• [学会発表] 小児急性骨髄性白血病におけるKIT D816V変異を有するマイナークローンの検出(The detection of minor clones with somatic KIT D816V mutations in pediatric de novo AML) (2018)
  • 著者名/発表者名: 佐々木 康二, 柴 徳生, 内山 由理, 池田 順治, 吉富 誠弘, 下里 侑子, 徳舛 麻友, 松尾 英将, 吉田 健一, 大木 健太郎, 大和 玄季, 原 勇介, 木下 明俊, 富澤 大輔, 多賀 崇, 足立 壯一, 多和 昭雄, 堀部 敬三, 松本 直通, 伊藤 秀一, 林 泰秀
  • 学会等名: 第80回日本血液学会学術集会
• [学会発表] 小児T細胞性急性リンパ性白血病におけるNOTCH1シグナル活性化変異の種類と臨床的特徴の解析(Analysis of features of alterations leading to activate NOTCH1 signaling in pediatric T-ALL) (2018)
  • 著者名/発表者名: 木村 俊介, 関 正史, 吉田 健一, 上野 浩生, 塩澤 裕介, 磯部 知弥, 大木 健太郎, 加藤 元博, 康 勝好, 小林 良二, 出口 隆生, 橋井 佳子, 今村 俊彦, 佐藤 篤, 清河 信敬, 真部 淳, 堀部 敬三, 小原 明, 眞田 昌, 小林 正夫, 岡 明, 林 泰秀, 宮野 悟, 小川 誠司, 滝田 順子
  • 学会等名: 第80回日本血液学会学術集会
• [学会発表] MLL転座急性骨髄性白血病におけるCCND3遺伝子変異の同定(Identification of recurrent CCND3 mutations in MLL-rearranged acute myeloid leukemia) (2018)
  • 著者名/発表者名: 松尾 英将, 吉田 健一,林 泰秀, 間野 博行, 宮野 悟, 上久保 靖彦, 小川 誠司, 足立 壯一 et al.
  • 学会等名: 第80回日本血液学会学術集会
• [学会発表] 小児急性骨髄性白血病におけるPTPN11、RAS、CBL変異の臨床的意義と予後解析(Clinical significance and prognostic analyses of PTPN11, RAS, and CBL mutations in pediatric AML) (2018)
  • 著者名/発表者名: 鏑木 多映子, 大和 玄季, 柴 徳生, 原 勇介, 大木 健太郎, 外松 学, 荒川 浩一, 清河 信敬, 富澤 大輔, 足立 壯一, 多賀 崇, 堀部 敬三, 林 泰秀
  • 学会等名: 第80回日本血液学会学術集会
• [学会発表] 小児T細胞性急性リンパ性白血病のDNAメチル化による分類と変異・発現・分化段階・予後との強い関連性(DNA methylation-based characterization of T-cell acute lymphoblastic leukemia well correlated with genetic features, prognosis and differentiation stages) (2018)
  • 著者名/発表者名: Kimura S, Seki M, Kawai T, Yoshida K, Isobe T, Ueno H, Shiozawa Y, Suzuki H, Shiraishi Y, Ohki K, Kato M, Koh K, Kobayashi R, Deguchi T, Hashii Y, Imamura T, Sato A, Kiyokawa N, Manabe A, Sanada M, Ohara A, Horibe K, Kobayashi M, Oka A, Hayashi Y, Miyano S, Hata K, Ogawa S, Takita J
  • 学会等名: 第60回日本小児血液・がん学会学術集会
• [学会発表] 再発時にKIT-ITDを認めたt(8;21)-AMLの一例(A case of t(8;21)-AML with internal tandem duplication of KIT at relapse) (2018)
  • 著者名/発表者名: Kaburagi T, Yamato G, Hara Y, Shiba N, Ohki K, Sotomatsu M, Shimada A, Hasegawa D, Manabe A, Hayashi Y
  • 学会等名: 第60回日本小児血液・がん学会学術集会
• [学会発表] Clinical significance of mutations of RAS pathway related genes including PTPN11, RAS, and CBL genes in pediatric AML -the JCCG study, JPLSG AML-05- (2018)
  • 著者名/発表者名: Kaburagi T, Yamato G, Shiba N, Hara Y, Ohki K, Sotomatsu M, Arakawa H, Kiyokawa N, Tomizawa D, Adachi S, Takashi T, Horibe K, Hayashi Y
  • 学会等名: SIOP－50th Congress of the International Society of Paediatric Oncology
  • 国際学会
• [学会発表] Pediatric myeloproliferative neoplasm-about the triple negative essential thrombocytosis (2018)
  • 著者名/発表者名: Shimada A, Ishida A, Koijima S, Hayashi Y
  • 学会等名: SIOP－50th Congress of the International Society of Paediatric Oncology
  • 国際学会
• [学会発表] Prognosis of pediatric AML patient with FLT3-ITD is predicted by DNA methylation pattern -the JCCG study, JPLSG AML-05- (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamato G, Kawai T, Shiba N, Ohki K, Hara Y, Kiyokawa N, Tomizawa D, Shimada A, Sotomatsu M, Arakawa H, Adachi S, Taga T, Horibe K, Hata K, Hayashi Y
  • 学会等名: SIOP－50th Congress of the International Society of Paediatric Oncology
  • 国際学会
• [学会発表] Age and NRAS mutation status are possible prognostic markers in pediatric acute myeloid leukemia with CBFB-MYH11 fusion gene (2018)
  • 著者名/発表者名: Hara Y, Shiba N, Ohki K, Yamato G, Sotomatsu M, Tomizawa D, Taki T, Kinoshita A, Kiyokawa N, Arakawa H, Tawa A, Horibe K, Taga T, Adachi A, Hayashi Y
  • 学会等名: SIOP－50th Congress of the International Society of Paediatric Oncology
  • 国際学会
• [学会発表] Integrated genetic analysis elucidated expression and methylation profiles of acute lymphoblastic leukemia in Down syndrome (2018)
  • 著者名/発表者名: Kubota Y, Uryu K, Ito T, Kawai T, Seki M, Isobe M, Toki T, Yoshida K, Kataoka K, Oki K, Kiyokawa N, Miyano S, Oka A, Hayashi Y, Ogawa S, Terui K, Sato A, Hata K, Ito E, Takita J
  • 学会等名: SIOP－50th Congress of the International Society of Paediatric Oncology
  • 国際学会
• [学会発表] Comprehensive Analysis of 343 Genes using Targeted Sequencing Panel by Next-Generation Sequencer In 77 Pediatric AML Patients with Normal and Complex Karyotypes: JCCG Study, JPLSG AML-05 (2018)
  • 著者名/発表者名: Kaburagi T, Yamato G, Shiba N, Yoshida K, Hara Y, Shiraishi Y, Ohki K, Sotomatsu M, Arakawa H, Matsuo H, Shimada A, Kiyokawa N, Tomizawa D, Taga T, Horibe K, Miyano S, Ogawa S, Adachi S, Hayashi Y
  • 学会等名: 60th ASH Annual Meeting and Exposition
  • 国際学会
• [学会発表] Effect of Age on the Prognosis of Molecular Abnormalities in Pediatric Acute Myeloid Leukemia (2018)
  • 著者名/発表者名: Hara Y, Shiba N, Yamato G, Ohki K, Sotomatsu M, Tabuchi K, Tomizawa D, Taki T, Kinoshita A, Kiyokawa N, Arakawa H, Shibuya M, Taga T, Tawa A, Horibe K, Adachi S, Hayashi Y
  • 学会等名: 60th ASH Annual Meeting and Exposition
  • 国際学会
• [学会発表] Recurrent Genomic Aberrations of D-Type Cyclins Are Therapeutic Targets of CDK4/6 Inhibitors in t(8;21) and MLL-Rearranged Acute Myeloid Leukemia (2018)
  • 著者名/発表者名: Matsuo H, Yoshida K, Fukumura K, Nakatani K, Noguchi Y, Takasaki S, Noura M, Shiozawa Y, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Okada A, Nannya Y, Takeda J, Ueno H, Shiba N, Yamato G, Kiyokawa N, Tomizawa D, Taga T, Tawa A, Hayashi Y, Mano H, Miyano S, Kamikubo Y, Ogawa S, Adachi S
  • 学会等名: 60th ASH Annual Meeting and Exposition
  • 国際学会