| 研究課題/領域番号 |
17K10207
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
平子 善章 名古屋大学, 理学研究科, 講師 (50377909)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ヘミデスモソーム / コラーゲン |
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| 研究実績の概要 |
先天性表皮水疱症の多くは細胞-基質間接着装置ヘミデスモソームの関連分子の遺伝子変異が原因となって起こる。本研究計画では先天性表皮水疱症の表現型の背後に存在する特有の病理の分子メカニズムをヘミデスモソーム機能に注目して明らかにすることを目的としている。2017年度は、表皮水疱症モデル細胞株の作製とモデル細胞を用いたヘミデスモソーム機能の解析をおこなった。
１）私たちのこれまでの研究により、XVII型コラーゲン欠失DJM-1細胞において、基底膜タンパク質の沈着パターンに異常が認められることがわかった。XVII型コラーゲンのどのような機能が失われた結果、この異常が生じたのかを明らかにするため、XVII型コラーゲンの様々な部分欠失変異体を作製し、細胞に導入し、基底膜形成を観察した。現在、その結果を解析中である。
２）2017年度に作製したプレクチン欠失DJM-1細胞におけるヘミデスモソーム形成能を調べたところ、I型およびII型のいずれのタイプのヘミデスモソームもまったく形成されなかった。また、親細胞と欠失細胞の間でのプレクチン以外のヘミデスモソームタンパク質の発現量に、大きな差は認められなかった。これらの結果は報告されているプレクチン欠失型の遺伝性表皮水疱症で認められるヘミデスモソーム形成不全の表現型とよく一致する。今後はこの欠失細胞を用いて、ヘミデスモソーム形成におけるプレクチンの役割を明らかにする計画である。
３）XVII型コラーゲンのリン酸化アミノ酸部位を推定し、推定したアミノ酸の置換変異体を作製した。変異体をXVII型コラーゲン欠失DJM-1細胞に導入し、ヘミデスモソームを形成させたところ、一部の変異体では、ヘミデスモソーム形成の阻害や、逆にヘミデスモソーム解体の抑制が観察されることがわかった
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2017年度に作製済みとしていたBP230欠失細胞のクローンが凍結保存時の事故のため、失われてしまった。2018年度中に再度、作製とクローニングをおこなった。一方、XVII型コラーゲン欠失細胞を用いたヘミデスモソームの機能解析についてはほぼ予定通りに進めることができている。
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| 今後の研究の推進方策 |
プレクチンとBP230については、それぞれの欠失細胞の基本的な性質を解析しつつ、これら細胞内アンカータンパク質がヘミデスモソームの膜タンパク質の機能にあたえる影響について注目し、変異体を用いた解析をおこなう。また、プレクチンもしくはBP230の遺伝子を標的としたゲノム編集において、確かにフレームシフト変異がゲノムに生じているにも関わらず、ほぼ全長と等しいサイズのタンパク質が発現しているクローンが得られた。プレクチンとBP230にはN末端のコード領域に複雑なスプライシング産物が存在していることが知られており、このこととの関わりも含め今後の検討課題となった。
2019年度にはインテグリンbeta4とラミニンalpha3鎖の欠失細胞を作製も予定している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
欠失細胞作製計画に遅れが生じたため、マウスへの細胞注入による腫瘍形成実験とヘミデスモソーム単離画分の質量分析によるリン酸化アミノ酸同定実験が行えなかった。これらの未実行実験に使用する予定であった予算が未使用となった。今年度中にできるだけ速やかに実行できるように計画している。
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