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前年度の結果から、上皮・間葉系細胞の細胞数が汗腺分化に影響する可能性を検討するため、CK18遺伝子発現を絶対定量qPCRで測定した。胎生18日（E18）由来spheroidは間葉系細胞が少ないものでCK18発現量が多く、上皮細胞単独で最もCK18発現量が多かった。出生3日（PN3）由来spheroidでは間葉細胞数による差なく、上皮細胞単独と同程度のCK18発現を認めた。ウェスタンブロットでは上皮間葉細胞を等量混合したPN3由来spheroidでCK18蛋白発現が多かった。
3次元培養よる分化を検討するために上皮間葉細胞1：1のspheroidをコラーゲンゲル中で培養した。フィーダーとして線維芽細胞を共培養した。PN3由来spheroidでは、3日後にspheroid周囲に上皮様胞巣が伸長し、6日後には嚢腫状の構造を形成したが、E18由来spheroidの形態変化はなかった。PN3由来spheroidでは、フィーダー細胞数を調整することでCK18の遺伝子発現が確認出来た。
分化の効率化のため、汗腺が密に分布する肉球の上皮細胞を用いて上皮間葉細胞塊を作成した。酵素処理で表皮芽を真皮内に残したまま表皮を剥離し、真皮をコラゲナーゼで短時間処理することで、表皮芽が自然に脱落することを試みたが十分に採取出来なかった。E-Cadherin、CD140a抗体では上皮細胞および間葉細胞の分離はできなかった。酵素処理法をさらに調整することで、表皮芽が付着した表皮と、真皮成分を含む間葉組織を分離して採取できた。
全研究期間を通じて、足底皮膚由来の上皮間葉細胞を用いて上皮間葉細胞塊あるいはspheroidを作成し皮膚付属器への分化誘導を試みた。毛包への分化誘導は可能であったが、汗腺への分化誘導は達成できなかった。今後、確立した酵素処理法により得た上皮細胞間葉細胞から汗腺の分化を誘導する予定である。
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