| 研究課題/領域番号 |
17K10237
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
加納 宏行 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (40566494)
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| 研究分担者 |
清島 眞理子 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 教授 (00171314)
中村 光浩 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (30433204)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | アトピー性皮膚炎 / サイトカイン / スキンブロッティング / 非侵襲的検査 |
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| 研究実績の概要 |
皮膚角層バリア機能の低下はアトピー性皮膚炎（AD）発症・病態維持の原因のひとつである。特に角質細胞間脂質セラミドの脂肪酸側鎖の短鎖化は角層バリア機能低下の新しい原因である。我々はIFNγによる短鎖化を培養ケラチノサイトとダニ抗原反復塗布による皮膚炎マウスで見いだしたが、代表的なTh1サイトカインIFNγが実際AD患者の角層バリア異常に関与しているのかは不明である。それを確実に検証するには皮膚生検等の侵襲的検査が必要となり、現時的には困難である。そこで我々は「スキンブロッティング法」を用いて、非侵襲的にAD 患者皮膚のサイトカイン環境をin situ で網羅的に測定し、角層セラミド組成、バリア機能、サイトカインの関連について解析を試みることを考えた。
スキンブロッティングとは、生理食塩水で湿らせたニトロセルロースメンブレンを皮膚表面に貼付して、皮膚の蛋白質を経皮的に採取し、抗体を用いて高感度に検出する方法である。平成29年度は、その基礎実験を主に行った。ターゲットはIL-4, IL-13, IL-31, IL-33, IFN-γ, TSLP, TNFα等であるが、AD患者皮膚はバリア機能が低下しており、アルブミン、グロブリンなどさまざまなタンパク質が採取されることが予想される。まず各抗体の特異性を組換えタンパク、人血清、アルブミン、グロブリン等を用いてまずウエスタンブロッティングで検討した。さらにSNAPi.d.という装置を用いて、一次抗体、二次抗体の濃度、反応時間等、装置の条件設定等の検討を行った。現在、患者から実際にスキンブロッティングを行いIL-4, IFN-γなどの抗体を用いたpilot studyに入ったところである。一部のサンプルで、IL-4, IFN-γが検出された可能性があるが、現在、技術的な確からしさを検証している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
実際の操作は比較的単純な実験であるが、抗体の特異性（特にアルブミン、グロブリンとの交差）等が必ずしも完全ではない抗体もあり、バリアの低下したAD患者からのスキンブロットの評価をする上で重要な課題として残っている。抗アルブミン抗体と抗サイトカイン抗体での二重染色法など、各種検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初、マウスを用いてスキンブロッティングで正しくサイトカインが検出できるかどうかを、抗体の特異性、スキンブロッティング条件設定の検討、生検組織との対比を含めた検討で確かめる予定としていた。しかし、最終目的がヒトでのサイトカイン検出なので、抗体の特異性等を抗マウスサイトカイン抗体で行うことは必ずしも賢明ではないと判断し、マウスでの検討を計画から外した。今後は、「現在までの進捗状況」でも述べたとおり患者でのスキンブロットによるサイトカイン検出の特異性の検証をしっかり行った上で、サンプル数を増やして、ADの状態（重症度、急性・慢性、皮疹の種類、患者のprofile等）との関連や、IL-4, IFN-γ以外のサイトカインについての検討も進める。十分な検討の後、経表皮水分蒸散量（TEWL）、角層脂質分析とあわせた解析へと最終的には進めていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今後の研究の推進方策に記載したとおり、当初予定していたマウスを用いたスキンブロッティング実験を行わなかった。そのため、研究分担者、中村先生との共同で行う予定だったマウス皮膚の角層脂質解析に必要な経費が余る結果となった。次年度以降で、患者および健常者の角層脂質解析を行う際に用いる予定である。
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