構造方程式モデリングを用いて統合失調症末梢血の研究成果を統合し、病態解明に繋げる

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K10281
• 研究機関: 滋賀医科大学
• 研究代表者: 尾關 祐二 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (90303768)
• 研究分担者: 藤井 久彌子 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (70314151)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 統合失調症 / D-セリン / L-セリン / グリシン / グルタミン酸 / グルタミン / 構造方程式モデリング法 / BACS-J

研究実績の概要

これまでに統合失調症患者46人（男性27人、女性19人、平均年齢54.9±11.4、喫煙18人、平均罹病期間29.2±12.8年, 平均教育年数11.8±2.1年, クロルプロマジン換算抗精神病薬服用量814.7±634.0mg, PANSS得点74.3±16.9［陽性尺度14.5±5.1　陰性尺度23.8±5.7］、BACS-J得点48.7±48.7）の血漿中Glu, Gln, L-Ser, D-Ser, Glyを因子としたパス図を作成し、構造方程式モデリング法で解析を行ったところ、たところBACS-Jは年齢（p<0.01）及びGln濃度（p=0.37）と関連がみられた。PANSS得点とアミノ酸に関係はなく、陽性尺度および陰性尺度は共にGly濃度と有意な関係が認められた（各々p=0.12、p<0.01）。モデルのCFIはすべて0.92と妥当であった（CFI: comparative fit index：通常0.9以上が求められる）。今回の結果は、Glyと臨床症状、Glnと認知機能に何らかの本質的な関係があることを示しているのかもしれない。しかし今回検討されていない物質もあるなど、検討が必要な点が残されている。なお統計解析はSPSS Amos ver. 22.0を使用した。更に現在のところ85名でセリン合成酵素(PHGDH, PSPH, PSAT1)の遺伝子配列をリシークエンスしたところ、それぞれに変位を認め、特にPHGDHでは希な変位を伴ってL-セリン濃度が健常人の２SDを超えて上昇している被験者一名と健常人の１SDを超えて低下している被験者一名を見出した。各々の被験者の臨床症状の評価は終了しており、今後これら遺伝子変異の機能を培養細胞などを用いて確認する予定としている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成30年度までに収集できた検体は統合失調症患者150名、健常被験者150名を超えている。患者に対してはPositive and Negative Syndrome Scale: PANSSにて臨床症状を、Brief Assessment of Cognition in Schizophrenia: BACSにて認知機能が測定できている。予定をしていた各種物質の血中濃度測定に関しては、High performance liquid chromatography (HPLC）やElectro-chemiluminescence immunoassay (ECLIA)法を用いており、すでに手技が確立している。一部対象者についてはすでに血中濃度測定が終了しており現在も継続中である（測定をしている物質：グルタミン酸、グルタミン、L-セリン、D-セリン、グリシン、メチオニン、ホモシステイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、ビタミンB12、葉酸、スフィンゴ脂質）。尚一部結果を用いてすでに測定された物質間の関係性をAmos ver.22.0を用いて構造方程式モデリング法（SEM）にて解析し（内服内容、年齢、性別、罹病期間、喫煙習慣を外生因子として加えることで補正）、一定の結果を得ている。さらには予定通り平成30年度には一部遺伝子のリシークエンスやmRNA発現量測定を始めており、すでに興味深い遺伝子変異を2つ見出している。今後遺伝子変異の機能を解析する予定としており、全体として予定通りに研究が進んでいるといえる。

今後の研究の推進方策

現在得られている結果から更に例数を増加して構造方程式モデリング法（SEM）によって健常者で有意な関係があって統合失調症では有意な関係が無い反応経路の検討を行う。問題があると思われる経路を見いだせば、その経路に関連する酵素やその酵素の発現・機能調節に関連するタンパクや補酵素などをデータベースなどで特定し、それらの遺伝情報（DNA配列やメチル化パターンなど）などを解析する。具体的には下記手法を予定しておりすでに一部は結果を得ている。
●遺伝子情報の収集のための実験：・遺伝子配列に関してはコーディング部分やプロモーター部位に関連する部分はリシークエンスを行う遺伝子配列を対象者ごとに決定する。リシークエンスには確実性や効率性を求めて、次世代シークエンサーであるサーモフィッシャーサイエンス社のIon PGE及びIon Protonを使用する。・mRNA発現量は定量的PCR法を用delta-deltaCt法を用いる。プローブはApplied Biosystems社の既製品を用る。・メチレーションパターンの決定はパイロシークエンス法を用いる。
●実験結果の解析：　数学的解析で得られた結果を説明するような遺伝子配列やDNAメチル化の状態などを求めると共にmRNA発現量に関しても独立に健常者と評価することで状況を総合的に観察する。評価の際には患者群全体のみならず各個人や小集団で特定の問題点がないかも検討する。こうして得られた情報は統合失調症の病態につながる情報と考えられ、下記の展望に繋げてゆく。臨床症状との関連に関しても検討を行い、これまでの報告されている生物学的な指標と臨床症状との関連を俯瞰的に評価する、こうして得られた情報も最終的には下記のような発展過程へと還元し、疾患克服へつなげてゆく。

次年度使用額が生じた理由

平成30年度に使用する予定であった試薬が想定価格より若干安く購入できたことなどがあり、63，352円を使用せずにすんだため、次年度に持ち越すこととした。

研究成果

• [学会発表] The relationship between peripheral amino acids alteration and symptoms of schizophrenia including neurocognitive dysfunction. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yuji Ozeki
  • 学会等名: WFBS 2018 KOBE
  • 国際学会