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2017 年度 実施状況報告書

血管内皮細胞由来因子を用いた認知症前駆期における大脳白質高信号の治療法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 17K10291
研究機関群馬大学

研究代表者

倉知 正  群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (20271546)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2020-03-31
キーワード血管内皮細胞 / 細胞外小胞 / エクソソーム / オリゴデンドロサイト前駆細胞
研究実績の概要

血管内皮細胞由来の細胞外小胞(エクソソーム)に含まれるオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の生存・増殖を促進する分子を同定、この分子を包含するエクソソームを用いた白質病巣の修復法を開発することを目的として、平成29年度は下記の実績が得られた。
OPCの生存・増殖を有意に促進する活性をもつラット大脳皮質毛細血管内皮細胞(MVEC)由来エクソソームに加えて、ラット線維芽細胞(Rat-1)由来エクソソーム、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)由来エクソソームを調製し、それらに含まれるタンパク質を質量分析(nanoLC-MS/MS分析)により網羅的に半定量的に解析した。
質量分析による解析から、MVEC由来エクソソーム表面にフィブロネクチン(FN)が豊富に存在することを明らかにした。このことはELISAにおいても確認された。FNは細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)と相互作用することから、MVEC由来エクソソーム表面のFNとOPC表面のHSPGとの結合阻害がOPCにおけるエクソソームの取り込みに及ぼす効果を、フローサイトメトリーにより検討した。エクソソーム表面のFNとOPC表面のHSPGとの結合を阻害することでOPCによるMVEC由来エクソソームの取り込みが減少し、OPCの生存・増殖促進効果が減弱することを明らかにした。
エクソソームで発現が高いmicroRNAがOPC生存・増殖の促進に関与していると考えられることから、MVECおよびRat-1由来エクソソームからRNAを調製、microRNA定量PCRパネルにより解析した。また、MVEC由来エクソソームに含まれるmicroRNAのライブラリーを構築してmicroRNA-Seq解析により発現プロファイルを得た。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の計画通り、MVEC由来エクソソームに含まれるタンパク質およびmicroRNAの網羅的解析を進めた。さらに、OPCの生存・増殖の促進に関与するエクソソーム由来のmicroRNAについて候補分子を絞り込むために、MVEC由来エクソソームを添加したOPCおける発現遺伝子のRNA-Seq解析を行った。これらの解析結果に基づいてデータベースを活用してOPCの生存・増殖に関わる候補因子(タンパク質およびmicroRNA)の探索を進めている。

今後の研究の推進方策

質量分析による解析結果をもとにMVECおよびRat-1由来エクソソームに含まれるタンパク質群を比較し、MVEC由来エクソソームに多く含まれるタンパク質を絞り込む。これらのタンパク質についてデータベース(KEGGなど)を利用したパスウェイ解析などを行い、OPCの生存・増殖を促進する候補タンパク質を得る。候補タンパク質がエクソソーム表面タンパク質である場合、OPC培養系を用いて候補タンパク質のアンタゴニストによる阻害実験を行い、OPCの生存・増殖に効果をもつタンパク質を同定する。一方、候補タンパク質がエクソソーム内部タンパク質である場合、候補タンパク質遺伝子をOPCに導入して過剰発現させ、OPCの生存・増殖に効果をもつタンパク質を同定する。
また、MVEC由来エクソソームに含まれるmicroRNAのmicroRNA-Seq解析、MVEC由来エクソソームを添加したOPCおけるmRNA発現プロファイルからOPC生存・増殖の促進に関与すると考えられる候補microRNAを得る。これらの候補microRNAについてOPCにおける過剰発現・機能阻害を行い、エクソソーム処理と同様にOPCの生存・増殖促進を誘導するmicroRNAを同定する。
レンチウイルスベクターを利用して高濃度で目的タンパク質を表面あるいは内包するエクソソームをHEK293細胞などに産生する系を構築する。同様に、レンチウイルスベクターにより高濃度で目的microRNAを内包するエクソソームをHEK293細胞などに産生する系を構築する。得られるエクソソームを培養OPCに添加してOPCの生存・増殖を促進するエクソソームをスクリーニングする。

次年度使用額が生じた理由

(理由)予定していたよりも少ない回数の初代培養により一定の成果が得られたため、実験動物(ラット)や細胞培養用試薬などに関わる経費が当初の見積額より抑えられ、次年度使用額が生じた。
(使用計画)培養系を用いた候補タンパク質の阻害実験や、候補miRNAの過剰発現・機能阻害実験に関わる試薬などの経費として使用する。

  • 研究成果

    (8件)

すべて 2018 2017

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (6件)

  • [雑誌論文] BMP4 signaling in NPCs upregulates Bcl-xL to promote their survival in the presence of FGF-22018

    • 著者名/発表者名
      Yamamoto Hanako、Kurachi Masashi、Naruse Masae、Shibasaki Koji、Ishizaki Yasuki
    • 雑誌名

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      巻: 496 ページ: 588~593

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2018.01.090

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Fibronectin on extracellular vesicles from microvascular endothelial cells is involved in the vesicle uptake into oligodendrocyte precursor cells2017

    • 著者名/発表者名
      Osawa Sho、Kurachi Masashi、Yamamoto Hanako、Yoshimoto Yuhei、Ishizaki Yasuki
    • 雑誌名

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      巻: 488 ページ: 232~238

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2017.05.049

    • 査読あり
  • [学会発表] Effect of extracellular vesicles from X-ray irradiated glioblastoma cells on survival, proliferation and motility of oligodendrocyte precursor cells2018

    • 著者名/発表者名
      石崎泰樹, 倉知 正, 山口舞花, 山本華子, 吉田由香里, 大澤 祥, 行木信一, 高橋昭久
    • 学会等名
      The 8th Conference of International Society of Radiation Neurobiology
  • [学会発表] X-ray irradiation induces disruption of the blood-brain barrier with localized changes in claudin-5 and activation of microglia in the mouse brain2018

    • 著者名/発表者名
      吉田由香里, 瀬下幸彦, 倉知 正, 石崎泰樹, 中野 隆史, 高橋昭久
    • 学会等名
      The 8th Conference of International Society of Radiation Neurobiology
  • [学会発表] FGF-2とBMP4シグナルによるBaxを介したアポトーシスの制御2017

    • 著者名/発表者名
      山本華子, 倉知 正, 成瀬雅衣, 柴崎貢志, 石崎泰樹
    • 学会等名
      第40回日本分子生物学会年会・第90回日本生化学会大会
  • [学会発表] Fibronectin on the surface of microvascular endothelial cell-derived extracellular vesicles mediates their uptake into oligodendrocyte precursor cells2017

    • 著者名/発表者名
      大澤 祥, 倉知 正, 山本華子, 好本裕平, 石崎泰樹
    • 学会等名
      第60回日本神経化学会大会
  • [学会発表] Fibronectin on extracellular vesicles from microvascular endothelial cells mediates vesicle uptake into oligodendrocyte precurs2017

    • 著者名/発表者名
      大澤 祥, 倉知 正, 山本華子, 好本裕平, 石崎泰樹
    • 学会等名
      第40回日本神経科学大会
  • [学会発表] 正常脳組織における放射線急性障害の解析2017

    • 著者名/発表者名
      吉田由香里, 瀬下幸彦, 倉知 正, 石崎泰樹, 中野隆史, 高橋昭久
    • 学会等名
      第55回日本放射線腫瘍学会生物部会学術大会

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公開日: 2018-12-17  

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