研究課題
本研究は、細胞致死あるいは放射線増感に直結する原因タンパク質を生化学的アプローチにより同定し、放射線あるいは他の療法との併用による抗腫瘍効果における真の標的を明らかにするとともに創薬に向けた土台を構築することを目的とする。正常細胞と様々な癌組織由来の培養細胞を用いて、エックス線、紫外線、抗がん剤や温熱などの単独あるいは併用時によるタンパク質の挙動について二次元電気泳動および質量分析装置を使用したプロテオーム解析を実施した。その結果、温熱処理あるいはエックス線・温熱併用時特異的に発現量が低下する因子としてSerine-Threonine Kinase 38 (STK38)を同定した。STK38の発現低下はタンパク質分解酵素の阻害剤であるALLNやCalpeptinなどによって抑制されたことから、遺伝子発現レベルによる調節ではなく、タンパク質分解経路による翻訳後修飾によるものであると推測された。次に温熱単独およびエックス併用時のSTK38のユビキチン化・SUMO化について、抗STK38抗体による免疫沈降産物に対する抗ユビキチン抗体や抗SUMO抗体を用いたWestern blotting法により解析を行った。温熱・エックス線の単独・併用時においてはSTK38のSUMO化は検出されなかったが、ユビキチン化が亢進していた。さらに温熱処理時のSTK38の発現低下はカルパイン阻害剤として知られるCalpeptinによって阻害されることが判明した。以上のことから、温熱単独あるいはエックス線併用時にSTK38の発現抑制が起こること、そしてそれらはユビキチン化やカルパインの活性化に伴うものであることが推察された。
2: おおむね順調に進展している
これまでに様々な細胞株を用いて温熱処理単独およびエックス線併用時にSTK38のタンパク質分解が起こることを見出した。さらにSTK38発現低下はプロテアソーム阻害剤やカルパイン阻害剤により抑制されたことから、ユビキチン化やカルパイン経路の活性化によるものであることが推察された。そこで抗STK38抗体による免疫沈降産物に対するユビキチン化を検討したところ、温熱単独・エックス線併用時にSTK38のユビキチン化が亢進することが判明した。現在、in vitroのけるSTK38 degradation assayに向けて各構成因子のリコンビナントタンパク質を作成している。一方、エックス線や温熱処理時に細胞内でSUMO化が起こっていることは抗SUMO抗体を用いたWestern blotting法により確認できたが、処理前後において二次元電気泳動のスポットの差として捉えるまでには至っていない。細胞を処理する際のSUMO化が起こる条件の最適化、二次元電気泳動における等電点の範囲の検討やSUMO化濃縮カラムの改良をさらに進めることによってSUMO化検出の改善を図る予定である。一方、SUMO発現ベクターやshRNAベクターを構築し、現在、それらの安定発現株の取得を目指している。
DNA損傷の初期過程では、AT (Ataxia Telangiectasia)の原因遺伝子産物であるATMのリン酸化を始めとした翻訳後修飾やDNA修復複合体形成 (MRN complex; Mre11, Rad50, Nbs1 complex)などのタンパク質-タンパク質間相互作用がDNA損傷シグナル伝達のイニシャルイベントとして起こる (Enomoto and Miyagawa, Prog.Theor. Phys. 2008)。これらのイニシャルイベントに続いて、細胞・損傷の重篤度に応じた特異的なシグナル伝達経路の活性化が起こり、DNA修復、細胞周期停止、細胞死などの細胞応答が誘導される。そこで同定したタンパク質のうち、放射線感受性に影響を与える因子について、過剰発現系、発現抑制、変異体における温熱や放射線応答を詳細に分析し、翻訳後修飾の意義を明らかにする。具体的には、DNA二重鎖切断のマーカーであるγ-H2AX を指標とした免疫染色やComet assayによるDNA修復能の解析、フローサイトメーターを用いて細胞周期分布を指標としたチェックポイント制御や細胞死の解析を通じて、感受性の修飾がどの応答プロセスの破綻あるいは保護によるものかを検討する。さらに放射線・温熱によるSUMO化タンパク質の検出感度を上げるため、濃縮カラムの改良や二次元電気泳動の条件検討、免疫沈降産物の検出改良を行う。
放射線・温熱によって誘導される翻訳後修飾に伴うタンパク質の挙動変化という点においては順調に研究が進行しており、試薬・消耗品の点において想定していたよりも節約が可能となった。一方、SUMO化タンパク質の濃縮カラムや検出抗体については未だ感度よく機能する抗体を市販品の中から見つけることができておらず、こちらに関しては目的にかなうツールを自前でそろえる準備を行っているため、費用を抑制できている。
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Mol. Cancer Ther.
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10.1158/1535-7163.MCT-16-0554
Apoptosis
10.1007/s10495-017-1402-2.
