| 研究課題/領域番号 |
17K10492
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
深田 淳一 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (50338159)
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| 研究分担者 |
公田 龍一 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (00464834)
小池 直義 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (60464913)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 膠芽腫 / 低線量照射 / 細胞周期 |
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| 研究実績の概要 |
前年度に続いて、低線量反復照射を①膠芽腫細胞系（全細胞周期）②G2-M期同調に施行し、生存率、細胞周期、DNA損傷について解析した。
本年度は生存率の差が最も顕著である照射間隔0分（単回照射）と30分間隔による低線量反復照射（20cG×10回）に条件を絞りこみ、照射後の細胞周期の変化について前年度より照射後の時間経過を詳細に追跡した。生存率はトリパンブルー染色法、細胞周期はPI染色によりDNA量を測定するほか、M期を特定できるヒストンH3抗体染色を追加し。フローサイトメトリーを用いて測定した。前年度は細胞周期に明らかな差を観察できなかったが、時間スケールを増加することでG2/M期の増加が観察された。これは、単回照射と低線量反復照射いずれでも観察され、複数の膠芽腫細胞系（U251、LN428、LN229）でも同様の反応があることが確認された。
引き続いて、細胞同調（G2-M期）について本年度もシェイクオフ法を継続した。前項と同様に生存率はトリパンブルー染色法、細胞周期はPI染色、ヒストンH3抗体染色を用い、フローサイトメトリーを用いて測定した。トリパンブルー染色、細胞周期解析ともに死細胞の混在が多い結果であった。十分な細胞数を安定して得ること、G2/M期、M期分画が安定して増加することのいずれも困難であった。
DNA損傷と修復については、前年度に引き続きγH2AX抗体を用いて、免疫染色で蛍光を観察した。単回照射、低線量反復照射ともに、照射後早期から蛍光の観察が可能であり、経時的に減少した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
通常の細胞周期にある培養細胞に対する低線量反復照射とその細胞応答のうち、照射に対する生存率の差が細胞周期にあるという仮説に基づき、本年度は測定ポイントを増やして再度実験を行った。この結果としてG2/M期の細胞分画が明らかに増加しているタイムポイントを見いだすことができた。前年度は見いだせなかった点であり、重要な発見と考えている。解析した細胞数、生存率の差に有意差は指摘できなかったが、今回の線量2Gyでは、殺細胞効果は限定的であり、以前に行った解析でアポトーシス分画の増加が軽度であったことと矛盾しない。シェイクオフ法によるG2/M期の細胞回収についても、前年度に引き続き行った。シェイクオフ法は細胞毒性が低いため、本研究で応用可能か優先して検討したためである。今回の培養細胞ではトリパンブルー染色に加えて、フローサイトメトリー法による解析も追加したが、いずれも死細胞の混在が多い結果となり、本方法での分画割合の増加を安定して得ることは難しいと判断した。DNA損傷と修復については、タイムポイントを追加して検討を進める必要がある。
本年度は、前年度の実験結果を検討して、追加修正を行ったため、進捗状況としては当初の予定より遅れている。しかしながら、細胞応答においては、前年度見出せなかった所見を見出しており、G2/M期の細胞回収においては、別の手法を講じる方針を確定することができたため、全体として確実に進捗しており、一定の結果を得ることができたと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1）全細胞周期の細胞に低線量反復照射を行い回収し、DNA損傷、アポトーシス分画といった細胞死について時間経過を増加したうえで再度詳細に検討する。
G2/M期の細胞の同調を目的に、ノコダゾールなどの細胞周期をブロックする薬剤を併用して細胞回収を行い、ノコダゾールなど使用する薬剤の毒性についても調べる。回収した細胞をフローサイトメトリー法で測定し、細胞周期の分画を測定する。効果的なG2/M期の細胞回収方法を確立する。
2）放射線超感受性の機序解明として細胞周期関連因子、DNA損傷応答関連因子に絞り込み解析を行う。タンパク解析としてウェスタンブロッティングを行い、関連が示唆された場合、さらに遺伝子解析としてPCRを行う予定である。進捗状況に応じてマイクロアレイを用いた網羅的解析を行い、低線量放射線超感受性に関与している遺伝子候補を探索する。関連する遺伝子を見出することができたら、阻害剤と低線量照射との併用を行い、細胞応答を測定することで、有効な放射線増感剤を見出す。
3）臨床応用における有効性を検討する目的で実験動物(マウス)を用いたin vivo での検討を行う。膠芽腫細胞系をヌードマウス大腿皮下に移植し、腫瘍を形成させる。コントロール、通常線量（2Gy）照射、低線量反復放射線照射、低線量反復照射と細胞同調薬剤投与併用による処置を行い腫瘍増殖率、生存期間を測定する。動物実験では、細胞周期・DNA損傷に加え、低線量反復照射が腫瘍微小環境に与える影響を調べるため、低酸素マーカー（HIF-1α）、血管内皮マーカー（CD34）の発現についても検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
若干の次年度使用額が生じたが、効率的な試薬購入などを行ったためである。
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