微小環境を伴うヒト膵オルガノイドの再構成に基づく新規膵癌薬剤評価系の構築

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K10517
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 上野 康晴 横浜市立大学, 医学部, 助教 (60375235)
• 研究分担者: 谷口 英樹 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (70292555)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 癌微小環境 / 癌オルガノイド / 治療抵抗性 / 薬剤評価

研究実績の概要

本研究では、ヒト膵癌を対象とするin vitro薬剤評価系の確立に向けて、腫瘍微少環境を有するヒト膵癌組織を人為的に再構成するための基盤技術を確立することを目的としている。研究初年度では、我々が先行研究において確立した実質細胞と間葉系細胞の三次元共培養技術が膵癌の再構成に適応可能か否かの検証を行った。
はじめに、膵癌の代表的な細胞株（CFPAC-1, PANC-1, CAPAN-2等）とストロマ細胞（血管内皮細胞・間葉系細胞）を三次元的に共培養し、膵癌オルガノイドが再構成されるか否かを評価した。三次元共培養早期から細胞凝集が生じ、立体的な細胞業集塊（膵癌オルガノイド）が形成された。膵癌オルガノイド内では間葉系細胞に被覆された血管内皮細胞のネットワーク様構造が形成されていた。膵癌オルガノイドを免疫不全マウスに移植したところ、間質豊富なゼノグラフトが形成されることが確認された。移植の対照群（膵癌細胞のみの移植群）では、間質に乏しいゼノグラフトは形成されることが確認された。次いで、ゼノグラフトを対象として膵癌の代表的な治療薬（ゲムシタビン）の薬剤感受性を評価した。その結果、膵癌オルガノイド移植群は膵癌細胞単独移植群と比べて、高い薬剤抵抗性を示すことが明らかとなった。以上より、ヒト膵癌の微小環境を再構成するための基盤技術を確立した。
次いで、癌オルガノイドのin vitro薬剤感受性を評価した。ルシフェラーゼ遺伝子を導入した膵癌細胞株を樹立し、ストロマ細胞との共培養により膵癌オルガノイドを作製し、抗癌剤への抵抗性を評価した。その結果、膵癌細胞単独培養群と比べて膵癌オルガノイドはin vitroにおいて、様々な薬剤に対して抵抗性を示すことが確認された。
以上より、in vitroおよびin vivoにおいて膵癌の治療抵抗性を再現する評価系を確立した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度の当初計画は、(1) 膵癌細胞とストロマ細胞との三次元培養技術の確立、(2) 膵癌に特徴的な豊富な間質を伴う膵癌オルガノイドの創出技術の確立としていた。
項目(1)については、我々が先行研究において確立した実質細胞と間葉系細胞の三次元共培養技術を活用し、培養条件を最適化することにより膵癌オルガノイドの創出技術を速やかに構築することができた。項目(2)については、 項目(1)での細胞混合比の検討と移植実験を有機的に連動させた結果、比較的スムーズに進めることができた。
概ね、当初計画通りに進めることができた。

今後の研究の推進方策

本年度に確立した、ヒト膵癌オルガノイドの再構成法を活用し、スループットの高いヒト膵癌の薬剤評価系を確立するための検討を進める。具体的には、マルチウエルプレート（96 wellや386 well等）の培養皿上で膵癌オルガノイドイトを再構成するための条件検討に取り組む。小型で均質なサイズの膵癌オルガノイドを安定的に再構成する手法を確立することにより、安定性・再現性の高い薬剤評価系を確立する。また、現時点においてはマルチウエルプレート内で培養した膵癌オルガノイドの薬剤感受性を効率よく評価する手法が確立されておらず、薬剤評価を確立する上での課題となっている。そこで、培養皿の全域から顕微鏡画像を取得しイメージングにより薬剤感受性を評価する手法などの網羅性とスループットを兼ね備えた細胞評価法の確立を進める。
以上を平行して進めながら、癌微小環境を伴う膵癌オルガノイドを用いた新規薬剤アッセイ系の確立を進める。

次年度使用額が生じた理由

研究の過程で膵癌オルガノイドの薬剤評価を効率よく実施するために有益な培養条件が明らかとなった。実験規模を拡大するため、海外より培養用試薬を取り寄せたが、供給が不安定となっており予定以上の納期が必要となることが判明した。代わりの培養試薬を検討したが、同等の性能を有する製品を調達することができなかった。次年度において、海外製の培養試薬の供給体制が整った後、検討を進めることとした。

研究成果

• [雑誌論文] Hepatic stem cells with self-renewal and liver repopulation potential are harbored in CDCP1-positive subpopulations of human fetal liver cells. (2018)
  • 著者名/発表者名: Zhang RR, Zheng YW, Li B, Nie YZ, Ueno Y, Tsuchida T, Taniguchi H.
  • 雑誌名: Stem Cell Res Ther. 巻: 5;9(1):29 ページ: none
  • DOI: 10.1186/s13287-017-0747-3.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Human iPSC-Derived Posterior Gut Progenitors Are Expandable and Capable of Forming Gut and Liver Organoids. (2018)
  • 著者名/発表者名: Zhang RR, Koido M, Tadokoro T, Ouchi R, Matsuno T, Ueno Y, Sekine K, Takebe T, Taniguchi H.
  • 雑誌名: Stem Cell Reports. 巻: 13;10(3) ページ: 780-793
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2018.01.006.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. (2017)
  • 著者名/発表者名: Camp JG, Sekine K, Gerber T, Loeffler-Wirth H, Binder H, Gac M, Kanton S, Kageyama J, Damm G, Seehofer D, Belicova L, Bickle M, Barsacchi R, Okuda R, Yoshizawa E, Kimura M, Ayabe H, Taniguchi H, Takebe T, Treutlein B.
  • 雑誌名: Nature 巻: 22;546(7659) ページ: 533-538
  • DOI: 10.1038/nature22796.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells. (2017)
  • 著者名/発表者名: Takebe T, Sekine K, Kimura M, Yoshizawa E, Ayano S, Koido M, Funayama S, Nakanishi N, Hisai T, Kobayashi T, Kasai T, Kitada R, Mori A, Ayabe H, Ejiri Y, Amimoto N, Yamazaki Y, Ogawa S, Ishikawa M, Kiyota Y, Sato Y, Nozawa K, Okamoto S, Ueno Y, Taniguchi H.
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 5;21(10) ページ: 2661-2670
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2017.11.005.
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] 創薬への応用を目指すヒューマン・オルガノイド研究の最前線 (2018)
  • 著者名/発表者名: 谷口 英樹
  • 学会等名: 第4回再生医療産業化展
  • 招待講演
• [学会発表] ヒトiPSC肝芽の臨床応用に向けた安全性評価手法の確立 (2018)
  • 著者名/発表者名: 濱田 侑希、関根 圭輔、都築 周作、小林 達也、安居 良太、上野 康晴、武部 貴則、池田 一貴、谷口 英樹
  • 学会等名: 第17回日本再生医療学会総会
• [学会発表] ラット胎仔肝組織移植による肝線維化モデルの治療効果の検討 (2018)
  • 著者名/発表者名: 大城 克友、村田 聡一郎、今野 孝浩、森 淳祐、松木 康一郎、土田 倫範、谷口 英樹
  • 学会等名: 第17回日本再生医療学会総会
• [学会発表] 大血管付与臓器の創出に向けた次世代組織培養技術の開発 (2018)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 優衣、田所 友美、松野 達也、山里 輔、谷口 英樹
  • 学会等名: 第17回日本再生医療学会総会
• [学会発表] iPS細胞を用いたヒューマン・オルガノイド研究の新展開 (2017)
  • 著者名/発表者名: 谷口 英樹
  • 学会等名: 第42回日本肝臓学会西部会
  • 招待講演
• [学会発表] iPS細胞を用いたヒューマン・オルガノイド技術の新展開 (2017)
  • 著者名/発表者名: 谷口 英樹
  • 学会等名: 第35回日本ヒト細胞学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] ヒト臓器の創出を目指す戦略的iPS細胞研究 (2017)
  • 著者名/発表者名: 谷口 英樹
  • 学会等名: Primary Care Dr. Summit 2017
  • 招待講演
• [学会発表] がん微小環境の再構成を目指すヒト膵癌オルガノイド創出技術の開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 谷口 英樹
  • 学会等名: 第26回日本癌病態治療研究会
  • 招待講演
• [学会発表] iPS細胞を用いたヒューマン・オルガノイド技術の新展開 (2017)
  • 著者名/発表者名: 谷口 英樹
  • 学会等名: 第103回日本消化器病学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] 微小環境を伴うヒト膵オルガノイドの再構築に基づく新規膵癌薬剤評価系の構築 (2017)
  • 著者名/発表者名: 上野 康晴、奥田 諒、金子 千夏、碓井 彩華、関根 圭輔、谷口 英樹
  • 学会等名: 第76回日本癌学会学術総会
• [学会発表] 腫瘍微小環境を模倣するヒト膵癌オルガノイドは薬剤耐性を示す (2017)
  • 著者名/発表者名: 関根 圭輔、奥田 諒、井上 達也、金子 千夏、碓井 彩華、上野 康晴、谷口 英樹
  • 学会等名: 第76回日本癌学会学術総会
• [学会発表] 癌微小環境を模倣した患者由来ヒト膵がんオルガノイドの創出 (2017)
  • 著者名/発表者名: 奥田 諒、関根 圭輔、上野 康晴、佐藤 準也、高橋 正希、井上 達也、金子 千夏、碓井 彩華、谷口 英樹
  • 学会等名: 第76回日本癌学会学術総会