| 研究課題/領域番号 |
17K10605
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| 研究機関 | 岩手医科大学 |
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研究代表者 |
岩谷 岳 岩手医科大学, 医学部, 講師 (70405801)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 食道癌 / 変異 / 血漿DNA / Circulating tumor DNA / デジタルPCR |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では食道扁平上皮癌を対象に、癌腫特異的遺伝子パネルを用いた次世代シークエンサーによる変異スクリーニングを行い、高MAFを有する検出変異のdigital PCRによる癌細胞由来の血漿中遊離DNA (Circulating tumor DNA: ctDNA)をモニタリングするシステムの構築を目標としている。これまでに36症例が登録され順調に症例集積、治療経過中の血漿サンプルを集積しており、研究は順調に経過している。独自デザインの31遺伝子を標的とした食道癌パネルを用いた治療前原発巣の次世代シークエンス解析では平均9個の遺伝子変異が検出された。ctDNAモニタリングするための症例特異的変異を標的とするPrimer/Probeの作成が一つの課題であったが、すでに60変異に対するPrimer/Probeを作成し、原発巣DNAを用いた動作確認を行った。これらのProbeを用いたctDNAモニタリングシステムは、Stage I症例のようなtumor burdenの小さい腫瘍の診断（早期診断）は難しいものの、Stage II以上の進行癌では化学療法の正確な効果判定、治療後の遺残腫瘍の存在の推定、3-6か月早い再発診断、予後予測に有用である可能性が示唆されている。本システムにより、食道癌の解析をすすめるとともに胃癌、大腸癌、乳癌をはじめ多種の癌腫でも解析を行っていく予定である。現段階では、症例特異的変異Probe/Primerの作成に時間とコストを要しており、多くの癌腫で変異が認められるTP53遺伝子を中心に、レア変異に対するProbeライブラリーの作成をすすめている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
食道扁平上皮癌36例が研究に登録済であり、治療前原発巣組織および治療前および手術、化学療法、放射線化学療法などの治療中、治療後の血漿サンプルを収集中である。独自デザインの31遺伝子を標的とした食道癌パネルを用いた治療前原発巣の次世代シークエンス解析では平均9個の遺伝子変異が検出された。症例特異的変異を標的とするPrimer/Probeを1症例につき1-3個合成しdigital PCRを用いctDNAの定量モニタリングを行った。現在、26例で2 time point以上でctDNA解析を行った。観察期間中央値は417.5日 (97-859)で、計300の血漿サンプルのctDNA解析を施行した。原発巣で検出された変異のうち変異アリル頻度 (MAF)が低い変異は血漿dPCR解析で陽性となりにくいため、MAFが10%以上の変異でctDNAモニタリングした。Stage I４例および術後病理標本で微小リンパ節転移が確認された表在癌 (pathological stage II) 1例では全例治療前後および最長２年半のfollow up中ctDNAは陰性であった。その他のStage II以上21例では全例で治療前血漿のctDNAが陽性であった。治療が奏功した場合ctDNAはMAF 0%まで下降し、無再発例ではctDNA陰性が持続していた。非奏功例ではctDNAの下降はないか緩徐であった。ctDNA陽性持続例や奏功例でもMAF: 0%の期間が持続しない症例は2年以内に死亡した。画像判定と化学療法効果Stable diseaseと診断されたがctDNAは増加を続けた症例では早期に肝転移出現し死亡していた。Stage II術後再発例では画像診断で再発が確認される６か月前よりctDNAの陽性化が確認された。症例および血漿サンプル収集により臨床経過とctDNAの推移に関するデータを集積中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究推進方策の１つとして、本研究で用いている「癌腫特異的遺伝子パネルを用いた次世代シークエンサーによる変異スクリーニングを行い、高MAFを有する検出変異のdigital PCRによるctDNAモニタリングシステム」の有用性を明らかにすることがある。現在ctDNA研究では、複数の遺伝子領域を解析可能な次世代シークエンサーによる血漿DNA解析やKRAS, EGFR, PIK3CA, BRAFなどのActionableなhotspot変異をdigital PCRでモニタリングに関する報告が多い。数週間ごとの化学療法サイクルの効果判定、再発疑い時の短期間での繰り返し検査、癌の5年のfollow upなど個々の患者の検査回数を考慮すると、１解析で数万～10万円のコストを要し解析に専門的知識・時間を要するNGSは臨床現場での血漿サンプルのモニタリングには実践困難と思われる。Digital PCR解析は1解析のコストは1000円程度、解析時間は数時間であり臨床実践は容易であるが、市販のHotspot変異assay以外の血漿モニタリングはほとんど行われていない。本研究で用いているシステムはHotspot変異を有さない食道癌のような癌腫を含めすべての悪性腫瘍に適用可能である。食道癌の解析をすすめるとともに胃癌、大腸癌、乳癌をはじめ多種の癌腫でも解析を行っていく予定である。症例特異的変異Probe/Primerの作成に時間とコストを要しており、レア変異に対するProbeライブラリーの作成をすすめている。特に多くの癌腫で変異が認められるTP53では同一癌腫、多癌腫でも共通した変異が見られ、これらの変異Probeライブラリーの存在は判定までの時間をさらに短縮することを可能とする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究に必要な試薬や物品に満たない残額が生じたため、次年度使用額として変異プローブのデザイン、合成に充当する予定である。
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