血中遊離ＤＮＡのモニタリングによる疾患プロファイルの構築と個別化治療戦略

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K10650
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 宮倉 安幸 自治医科大学, 医学部, 准教授 (50306122)
• 研究分担者: 鈴木 浩一 自治医科大学, 医学部, 准教授 (70332369) ; 力山 敏樹 自治医科大学, 医学部, 教授 (80343060)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: デジタル PCR / 血中モニタリング / KRAS / 大腸癌 / 膵癌 / EGFR

研究実績の概要

【研究目的】我々は腫瘍のゲノムプロファイルがその進展・転移、治療の過程で変化する事に注目し、ゲノムプロファイルのモニタリングとその情報に基づく癌治療戦略の構築を進めてきました。しかし頻繁な生検や転移巣の検体採取が必要で、煩雑性や過大侵襲が大きな問題でした。その問題を解決したのが、血中に遊離した希少な腫瘍細胞やDNAを検出する技術「Liquid biopsy」です。我々が注目したのはKRAS遺伝子で、切除不能大腸癌の治療標的分子です。本研究では、薬剤耐性のみならず感受性回復の指標としての意義を検証し、薬剤の再導入の可能性を探ります。また原発巣と転移巣のKRAS statusの解離に注目し、KRAS statusに基づく治療介入方法を検討します。新たな医療アプローチとして、臨床応用を目指します。
【研究実績】平成30年度は、
（１）KRAS遺伝子の血中モニタリングの継続：「Liquid biopsy」でKRAS変異を血中モニタリングする事によって薬剤耐性の獲得をより鋭敏に捉える事が可能となり、薬剤耐性のみならず感受性回復、薬剤の再導入のへの指標となる事を報告しました。（Takayama Y.Oncotarget.2018）
（２）液滴ソーティングによる塩基配列解析と簡易解析システムのアプリケーション化：標的分子としてEGFRのモニタリングを追加しました。株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズのソーティングシステムを用いて循環腫瘍細胞の採取を行い、循環腫瘍DNAとの比較を行いました。大腸癌の分子標的治療薬であるRegorafenibの投与前後で循環腫瘍DNAを採取し、EGFRの発現レベルを比較すると、Regorafenibを投与することによりEGFRの発現レベルが上昇する事を確認しました。抗EGFR抗体の再投与が有効性を考える上で意義のある結果です。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

(１）KRAS遺伝子の血中モニタリングの継続
「Liquid biopsy」でKRAS変異を血中モニタリングする事によって薬剤耐性の獲得をより鋭敏に捉える事が可能となり、薬剤耐性のみならず感受性回復、薬剤の再導入のへの指標となる事を報告しました。（Takayama Y.Oncotarget.2018）
（２）標的循環遊離核酸の拡大と疾患プロファイルの構築
（３）液滴ソーティングによる塩基配列解析と簡易解析システムのアプリケーション化
標的分子としてEGFRのモニタリングを追加しました。株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズのソーティングシステムを用いて循環腫瘍細胞の採取を行い、循環腫瘍DNAとの比較を行いました。大腸癌の分子標的治療薬であるRegorafenibの投与前後で循環腫瘍DNAを採取し、EGFRの発現レベルを比較すると、Regorafenibを投与することによりEGFRの発現レベルが上昇する事を確認しました。抗EGFR抗体の再投与が有効性を考える上で意義のある結果です。

今後の研究の推進方策

（1）標的循環遊離核酸の拡大と疾患プロファイルの構築
標的分子を増やすことにより、個人の疾患プロファイルを構築します。血中モニタリングを行う事でリアルタイムに個人の疾患プロファイルの変化を捉え、治療や予防に応用する新たな個別化医療のアプローチとなります。まずはKRAS関連遺伝子であるNRAS、BRAFからはじめ、その後さまざまな標的分子を増やします。
（2）液滴ソーティングによる塩基配列解析と簡易解析システムのアプリケーション化
これまでの検討から循環遊離核酸の変異型が組織変異型と解離する症例が散見され、循環遊離核酸の塩基配列の検証が必要と考えられます。「デジタルPCR」で増幅された遺伝子が含まれる液滴をソーティング回収し、シークエンス解析に用いて塩基配列を同定します。この一連のプロセスをアプリケーション化します。

次年度使用額が生じた理由

消耗品価格の変動のため次年度使用額が生じました。消耗品購入の繰り越しにまわします。

研究成果

• [雑誌論文] Monitoring circulating tumor DNA revealed dynamic changes in KRAS status in patients with metastatic colorectal (2018)
  • 著者名/発表者名: Yuji Takayama, Koichi Suzuki, Yuta Muto, Kosuke Ichida, Taro Fukui, Nao Kakizawa, Hideki Ishikawa, Fumiaki Watanabe, Fumi Hasegawa, Masaaki Saito, Shingo Tsujinaka, Kazushige Futsuhara, Yasuyuki Miyakura, Hiroshi Noda, Fumio Konishi, Toshiki Rikiyama
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 9 ページ: 24398～24413
  • DOI: 10.18632/oncotarget.25309
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Methylation-Sensitive Amplification Length Polymorphism (MS-AFLP) Microarrays for Epigenetic Analysis of Human Genomes (2018)
  • 著者名/発表者名: Alonso Sergio、Suzuki Koichi、Yamamoto Fumiichiro、Perucho Manuel
  • 雑誌名: Methods in molecular biology 巻: 1766 ページ: 137～156
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-7768-0_8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Overexpression of satellite alpha transcripts leads to chromosomal instability via segregation errors at specific chromosomes (2018)
  • 著者名/発表者名: Ichida Kosuke、Suzuki Koichi、Fukui Taro、Takayama Yuji、Kakizawa Nao、Watanabe Fumiaki、Ishikawa Hideki、Muto Yuta、Kato Takaharu、Saito Masaaki、Futsuhara Kazushige、Miyakura Yasuyuki、Noda Hiroshi、Ohmori Tsukasa、Konishi Fumio、Rikiyama Toshiki
  • 雑誌名: International Journal of Oncology 巻: 52 ページ: 1685～1693
  • DOI: 10.3892/ijo.2018.4321
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Clinical significance of monitoring KRSA in tissue and serum of pancreatic cancer patients (2018)
  • 著者名/発表者名: Watanabe F, Suzuki K, Ishikawa H, Endo Y, Ichida K, Takayama Y, Fukui T, Kakizawa N, Kasahara N, Kato T, Noda H, Rikiyama T
  • 学会等名: Gastrointestinal Cancers Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] Dynamics and characteristics of KRAS mutated circulating tumor DNA in patients with metastatic colorectal cancer during various treatments (2018)
  • 著者名/発表者名: Takayama Y, Suzuki K, Ichida K, Fukui T, Kakizawa N, Watanabe F, Kikukawa R, Hasegawa F, Tsujinaka S, Miyakura Y, Konishi F, Rikiyama T
  • 学会等名: Gastrointestinal Cancers Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] Liquid biopsy leads to a paradigm shift in colorectal cancer treatments (2018)
  • 著者名/発表者名: Suzuki K, Takayama Y, Kakizawa N, Ichida K, Fukui T, Watanabe F, Ishikawa H, Saito M, Miyakura Y, Rikiyama T
  • 学会等名: 第73回日本消化器外科学会総会
• [学会発表] リキッドバイオプシーによる大腸癌診療のパラダイムシフト (2018)
  • 著者名/発表者名: 鈴木浩一
  • 学会等名: Saitama CRC Seminar
  • 招待講演
• [学会発表] 膵癌に対する組織と血中のKRASモニタリングの有用性 (2018)
  • 著者名/発表者名: 渡部文昭、鈴木浩一、遠藤裕平、笠原尚哉、加藤高晴、齊藤正昭、辻仲眞康、宮倉安幸、野田弘志、清崎浩一、力山敏樹
  • 学会等名: 第118回日本外科学会定期学術集会
• [学会発表] 膵癌に対する術前治療に組織と血中のKRASモニタリングは有用か (2018)
  • 著者名/発表者名: 渡部文昭、鈴木浩一、力山敏樹
  • 学会等名: 第104回日本消化器病学会総会学術集会
• [学会発表] Clinical significance of monitoring KRAS in tissue and plasma of pancreatic cancer patients (2018)
  • 著者名/発表者名: Watanabe F
  • 学会等名: 第17回自治医科大学シンポジウム
• [学会発表] Significance of monitoring vascular endothelial growth factor signals in blood during treatment of colorectal cancer patients (2018)
  • 著者名/発表者名: Kakizawa N, Suzuki K, Ishikawa H, Watanabe F, Kikugawa R, Tsujinaka S, Miyakura Y, Rikiyama T
  • 学会等名: 第17回自治医科大学シンポジウム
• [学会発表] Significance of monitoring VEGF signals in blood during treatment of colorectal cancer patient (2018)
  • 著者名/発表者名: 柿澤奈緒、鈴木浩一、石川英樹、渡部文昭、辻仲眞康、宮倉安幸、力山敏樹
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] リキッドバイオプシーによるがん診療のパラダイムシフト (2018)
  • 著者名/発表者名: 鈴木浩一
  • 学会等名: 第27回日本がん転移学会
  • 招待講演
• [学会発表] DNA脱メチル化異常をバイオマーカーとする胃切除範囲への臨床応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 齊藤正昭、清崎浩一、小櫃 保、伊瀬谷和輝、石岡大輔、辻仲眞康、宮倉安幸、鈴木浩一、野田弘志、力山敏樹
  • 学会等名: 第118回日本外科学会定期学術集会