| 研究課題/領域番号 |
17K10697
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
清水 一也 神戸大学, 保健学研究科, 保健学研究員 (50335353)
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| 研究分担者 |
三好 真琴 神戸大学, 保健学研究科, 助教 (50433389)
堀 裕一 神戸大学, 保健学研究科, 教授 (80248004)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 膵癌 / 抗がん剤耐性 / CD133 |
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| 研究実績の概要 |
研究の全体構想は抗がん剤耐性膵癌幹細胞の新規治療薬とバイオマーカーの開発である。我々はこれまでに正常膵幹細胞と高悪性度のヒト膵癌細胞が幹細胞マーカー(CD133)を発現することを明らかにした(Stem Cells 2008; Pancreas 2009; Pathobiology 2011)。また、既存の抗がん剤Gemcitabine(GEM)に耐性の膵癌患者から10種類のCD133陽性膵癌幹細胞株を樹立し、細胞外基質を再構築することで自己複製能を獲得することを明らかにした(PLoS One, 2013)。さらに、ヒト膵癌幹細胞株がGEMによるヒストンアセチル化を介してK-RasVal/MEKシグナルの下流であるMatrix Metalloproteinase-10 (MMP-10)の発現を促進することも明らかにした(Pancreas, 2017)。本研究ではGEM耐性により活性化したK-RasVal/MEK/MMP-10シグナル伝達を標的とした新規治療薬とバイオマーカーの開発を目指す。我々はこれまでに、マウス組織幹細胞に遺伝子導入してマウス人工膵癌細胞を作成している。この細胞は腫瘍形成能・転移能・抗がん剤感受性など様々な点でヒト膵癌組織と類似している(論文作成中)。初年度、この細胞を移植し、GEMの長期投与によりGEM耐性マウス人工膵癌細胞を作成することに成功したが、親株との比較からは耐性株におけるMMP-10の明らかな発現増強を認めなかった。一方、当該年度は我々が樹立したヒト膵癌幹細胞株を用いて、K-Ras/MEKシグナルの上流の因子として報告されているIntegrin-b3とFGF-2、FGFR1の発現がGEM耐性化により亢進することを明らかにした。我々はGEM耐性化したヒト膵癌組織でIntegrin-b3が高発現しているも明らかにしている。さらにMMP-10に活性制御を受けるMMP-1の発現がGEM耐性化により亢進されることも明らかにしている。MMP-1は膵癌の悪性度と予後不良因子として報告されている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(1) GEM耐性マウス人工膵癌由来膵癌幹細胞株におけるK-RasVal/MEK/MMP-10シグナル伝達機構の解析、(2) GEM耐性マウス人工膵癌阻害薬の同定
初年度は、マウス組織幹細胞に遺伝子導入して樹立したマウス人工膵癌幹細胞株を使って、in vivoで腫瘍形成させたのちにGEMを長期投与して、GEM耐性マウス人工膵癌細胞を樹立した。さらに、親株とGEM耐性株を解析するためマイクロアレイ解析を行ったが、MMP-10の発現増強を認めなかった。この結果から、変異型KRASG12Dの強制発現することによってK-RasVal/MEK/MMP-10シグナル伝達経路に変化が生じたことによりMMP-10の発現には差異が出なかったと考えた。そこで、我々が樹立したヒト膵癌幹細胞株に立ち戻り、GEM依存性に発現が促進される因子の再検索をおこない、MMP-1とintegrin-b3、FGF-2、FGFR1を同定した。MMP-1はMMP-10により活性化されること、さらに、integrin-b3とFGF-2、FGFR1は、K-Ras/MEKシグナルの上流因子として報告されている。次年度は、integrin-b3とFGF-2、FGFR1、MMP-1の制御機構を明らかにすることでシグナル伝達を標的とした新規治療薬とバイオマーカーの開発を目指す。また、４つの因子がGEM耐性マウス人工膵癌細胞でも同様に作用するかを評価する。
(3) GEM耐性予測因子の同定
初年度はマウス人工膵癌細胞親株とGEM耐性癌癌細胞の周囲間質のラミニンとコラーゲンIVの発現を測定したところ、GEM耐性膵癌細胞において発現の亢進を認めた。当該年度は、GEM耐性予測因子の同定のために、親株とGEM耐性膵癌株のマイクロアレイを行なった。現在候補となる因子の確認を行っている。また、GEM耐性マウス人工膵癌のエクソソームに含まれ、GEM耐性予後予測因子となる分子の同定を行なっている。一方、４つの因子が予測因子になるか、ヒト血清を用いて検索を行なっている。。以上の結果から、研究目的はおおむね順調に進展していると判断している。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では、我々が樹立したヒト膵癌幹細胞株とマウス人工膵癌細胞を用いてGEMにより活性化されたK-RasVal/MEK/MMP-10シグナル伝達機構を標的としたGEM耐性膵癌の新規治療薬の開発が目的である。初年度はマウス人工膵癌細胞親株由来腫瘍にin vivoでのGEM長期投与によりGEM耐性を獲得した腫瘍からGEM耐性マウス人工膵癌細胞を樹立したが、ヒト膵癌幹細胞とは異なり、親株に比べてMMP-10発現の亢進が認められなかったことから、変異型KRASG12Dの強制発現においては親株ですでにK-RasVal/MEK/MMP-10シグナル伝達機構が亢進しているものと結論づけた。当該年度は、ヒト膵癌幹細胞株でK-Ras/MEK/MMP-10シグナル伝達の上流と下流の因子と報告されているMMP-1とintegrinb3、FGF-2、FGFR1の因子を候補として同定した。最終年度は、ヒト膵癌幹細胞株でこれら因子の阻害がK-RasVal/MEK/MMP-10シグナル伝達を阻害するか詳細に検討する予定である。またMMP-10を含めたこれらの因子がGEM耐性予測因子となるか、患者血清を用いて検討する。さらに、GEM耐性予測因子の同定のために、マウス人工膵癌細胞親株とGEM耐性マウス人工膵癌細胞のマイクロアレイの結果から、候補となる因子を抽出してリアルタイムPCRやWestern blotting法による確認を行っており、同定できた因子について可能ならばELISA法の確立を行いたい。さらには、マウス人工膵癌親株由来腫瘍にGEMを投与して耐性を獲得する過程での候補分子の変化を検討する予定である。また、がん細胞が分泌するエクソソームが、がん特異性を持つことが明らかになっているので、マウス人工膵癌親株とGEM耐性マウス人工膵癌からエクソソームを分離回収して、エクソソームに含まれる遺伝子やmicroRNAを網羅的に解析することで、GEM耐性に関わる候補分子を同定する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
我々は、すでにマウス組織幹細胞にGFP、変異型KRASG12D、変異型p53、cyclin dependent kinase 4を遺伝子導入してマウス人工膵癌細胞(親株)を作成している。この細胞は腫瘍形成能・転移能・抗がん剤感受性など様々な点で、臨床で遭遇するヒト膵癌組織と類似している(論文作成中)。初年度、この細胞をマウスの皮下に移植し、腫瘍を形成させたのちに、既存の抗がん剤Gemcitabine(GEM)の長期投与により一旦腫瘍が縮小効果を示したのちに再度増大傾向を示した腫瘍からGEM耐性マウス人工膵癌細胞を樹立することに成功した。この耐性株は、in vitroでもin vivoでも親株と比較して明らかにGEM耐性であることを確認した。さらに親株とGEM耐性マウス人工膵癌細胞を網羅的に解析するためマイクロアレイ解析を行ったので、次年度使用額が生じた。次年度使用額はマイクロアレイ解析のための費用とそのパスウェイ解析のために使用する予定である。
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