| 研究課題/領域番号 |
17K10763
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
川人 宏次 自治医科大学, 医学部, 教授 (90281740)
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| 研究分担者 |
木村 直行 自治医科大学, 医学部, 准教授 (20382898)
中村 匡徳 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20448046)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 大動脈二尖弁 / 数値流体力学計算 / 壁せん断応力 / MMP |
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| 研究実績の概要 |
当グループは、数値流体力学計算による流体力学研究を用いて、大動脈二尖弁症例で生理的な2Pa程度の壁せん断応力を超える10Pa以上の壁せん断応力が大動脈壁に作用する可能性を示した（JTCVS, 2017;153:S52）。しかしながら，10Paを超える非常に高い壁せん断応力環境に対する内皮細胞の応答の詳細は明らかになっていない。
2019年度も、首都大学東京坂元尚哉准教授研究室と共同で、大動脈二尖弁の異常血流が大動脈壁に及ぼす生体変化の分子機構を解明するため、in vitro実験を実施した。まず、ヒト大動脈二尖弁症例の異常血流が上行大動脈に衝突する現象をシミュレーションするため、ローラーポンプにより産生されるjet噴流が血管内皮細胞に衝突する研究モデルを作成し、ヒト大動脈内皮細胞を用いた実験を行った。flow chamberから1.0m/sの平均流速を与え、内皮細胞に対しjet噴流を15分間負荷した後に、免疫蛍光染色を行ない、jet噴流負荷後の内皮細胞における接着因子発現を観察した。本研究は最大40Pa近い壁せん断応力が負荷される環境であるが、内皮細胞に対して衝突噴流を負荷した結果、壁せん断応力と法線方向動圧が高まる領域で細胞の剥離およびPECAM-1の発現低下が認められ、内皮細胞間接着は衝突噴流環境特有の影響を受ける可能性が示唆された（2020年5月25-27日 生体医工学会で発表予定）。また、内皮細胞-平滑筋細胞を使用した共培養モデルを使用した実験を行った結果、血管内皮細胞のMMP-2産生および平滑筋細胞のMMP-9 産生の増加が高せん断応力負荷に対する反応として見られ、高壁せん断応力環境下での内皮細胞および平滑筋細胞の応答が大動脈解離などの疾患発生に関与する可能性が示唆された（2019年12月20-21日金沢 第32回バイオエンジニアリング講演会で発表）。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
上記in vitro研究結果に加えて、自治医科大学の臨床研究倫理委員会の承認の元、名古屋工業大学中村匡徳教授の研究室と共同で、大動脈二尖弁症例を中心としたCFD解析研究を現在実施している。患者個体別で3次元造影CT検査やphase-contrast MRI検査データを使用したCFD解析を行い、壁せん断応力を中心とする血行力学因子の分布をそれぞれの症例で計測している。大動脈二尖弁症例で、大動脈壁せん断応力を中心とする血行力学パラメーターの分布マップを作成し、大動脈壁の組織学的変化との関連性を検証している。
上行大動脈置換術が実施される症例に関しては、せん断応力の高部位と低部位で大動脈組織のRNAを抽出することを目的として、上行大動脈壁の内膜～中膜組織を採取している。抽出したRNAを用いて、DNAマイクロアレイ法による網羅的遺伝子解析を行う予定である。
2020年3月までに大動脈二尖弁症例の大動脈検体は20例採取したが、検体採取に遅滞を生じたため、研究期間を1年間延長する形となった。今後も引き続き、試料収集を継続するが、予定症例数に近い患者組織検体が採取できたため、2020年度に遺伝子解析研究を実施する予定である。
また、首都大学東京坂元尚哉准教授研究室とのウシ／ヒト大動脈細胞（血管内皮細胞／血管平滑筋細胞）を使用したin vitro研究も継続して実施し、高せん断応力が上行大動脈壁の中膜・内膜細胞に及ぼす生体反応を、多角的に検証する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後も、共同研究機関である名古屋工業大学中村研究室と共同で、大動脈二尖弁症例の画像データと大動脈検体を使用した研究を継続する。
大動脈二尖弁手術症例から採取する上行大動脈に関しては、これまでの当グループ・他研究グループからの報告で、ほとんどの症例で、上行大動脈の大彎側が小彎側と比較して、壁せん断応力が上昇することが明らかになっている。これまで採取した上行大動脈検体は、各症例とも、上行大動脈の大彎側・小彎側のそれぞれ外膜と内膜中膜の層別に採取し冷凍凍結保存している。今後、内膜中膜組織の遺伝子発現を、大彎側 vs. 小弯側 もしく大動脈高度拡大 vs. 軽度拡大 でDNAマイクロアレイ法を使用して、網羅的に解析する。本研究により、異常血流による血行力学ストレスが大動脈壁に及ぼす変化を、分子細胞レベルで解明することを目標としている。また、将来的には、二尖弁症例の大動脈拡大の予測因子となる新規バイオマーカーの開発も視野に入れている。
また、首都大学東京坂元准教授の研究室とのこれまでの共同研究で、高せん断応力負荷が、大動脈の血管内皮細胞や血管平滑筋細胞のホメオスタシスを変化させ、大動脈壁組織の接着因子やMMP産生が影響を受ける可能性が示唆された。今後も、同研究室と大動脈壁細胞を使用するin vitro実験（大動脈内壁への衝突流を再現する流れ負荷回路）を引き続き行い、上記遺伝子発現解析研究との関連性を検証する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今回、研究期間延長に伴い、2020年度への次年度使用額が発生した。次年度使用額が発生した主な理由としては、本研究は、患者検体が一定数ないと実施できない遺伝子解析研究が研究の主体であることが挙げられる。当初の予測より、研究対象となる上行大動脈置換術を併せて行う大動脈二尖弁の重症大動脈弁狭窄症例が少なく、検体採取に遅滞が生じた。他には、新規の血流解析用のソフトウエアを購入しなかったことなどである。
繰り越し金を含めた2020年度の使用額は約170万円である。RNA抽出に関する消耗品の購入に20万円、DNAマイクロアレイ関連経費90万円、遺伝子発現解析経費20万円、in vitro実験に関連する消耗品の購入に20万円、学会発表・研究会議出席への旅費に20万円程度の支出を予定している。
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