2017 年度実施状況報告書

免疫療法に反応した肺癌患者における標的T細胞エピトープ探索システムの開発

研究課題

研究課題/領域番号	17K10775
研究機関	千葉大学
研究代表者	鈴木秀海千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (60422226)
研究分担者	金田篤志千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (10313024) 中島崇裕千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (20400913) 吉野一郎千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (40281547) 本橋新一郎千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (60345022)
研究期間 (年度)	2017-04-01 – 2020-03-31
キーワード	非小細胞肺癌 / 免疫チェックポイント / エピトープ
研究実績の概要	免疫チェックポイント阻害療法は、遺伝子変異の多い悪性黒色腫や肺癌で有効性が認められていることから変異蛋白由来の抗原が標的になっている可能性がある。本研究の目的は、日本人の非小細胞肺癌における免疫チェックポイント阻害療法の標的および治療反応予測因子を検討することである。全日本人の約80％に発現されるHLA-A2 やA24に提示されうる腫瘍由来T細胞エピトープ（T細胞の標的抗原）の数と共通抗原の存在に着目し、臨床腫瘍検体の全エクソーム解析から変異遺伝子を同定し、HLA-A2/A24親和性の高いアミノ酸配列モチーフをin silicoで解析する。再発・進行非小細胞肺癌に対しNivolumabで抗PD-1阻害療法を受ける予定、治療中、治療後の患者から、本研究への参加同意の得られた症例について、血液を採取し、SRL社に外注委託するため、千葉大学の医学倫理申請を申請し、患者に説明するための説明用紙、同意書の作成を行い、各解析を担当する教室や施設に研究体制の確認を行っている。今後さらにこれらのサンプルを収集後、腫瘍および非腫瘍サンプルの全エクソームの塩基配列を解析し、腫瘍由来T細胞エピトープのin silico探索を行う。さらに抗PD-1療法への反応とmissense変異数、候補となる腫瘍由来T細胞エピトープとの関係を解析していく。最終的には腫瘍由来T細胞エピトープの確認後に、生体内における腫瘍反応性T細胞の検出し、共通腫瘍由来T細胞エピトープによる特異的CD8陽性T細胞の誘導までを計画している。本研究は、千葉大学の呼吸器病態外科学、分子腫瘍学、免疫細胞医学、腫瘍内科学及びかずさDNA研究所の連携によって推進する予定であり、各教室の指導教官が随時研究の進捗状況のチェックを行う。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由研究計画は、①免疫チェックポイント阻害療法を受けた非小細胞肺癌患者の腫瘍および非腫瘍サンプルより全エクソームの塩基配列を解析し、全変異領域・様式を特定する。この際に各患者のHLA genotypeとその腫瘍組織における発現を確認しておく。②当該HLA genotypeに提示されうるアミノ酸配列モチーフをコードし得る変異遺伝子をin silicoで検索し、腫瘍由来T細胞エピトープの候補ペプチドを探索する。③免疫チェックポイント阻害療法の反応群と非反応群で、腫瘍由来T細胞エピトープ候補のプロフィール(数、共通抗原の有無)を比較検討する。④反応者で腫瘍由来T細胞エピトープ候補が多い、あるいは反応者間で共通T細胞エピトープがある、などの知見が得られれば、当該T細胞エピトープを合成してin vitroで合成HLA分子との結合能、T細胞の反応性などの免疫学的解析を行う事である。まずこれまで千葉大学呼吸器外科で術後再発や進行期肺癌に対し免疫療法を行った患者のリストアップを行い、対象患者の同定を行い、患者背景や、使用した薬剤、効果、副作用等の詳細な臨床情報を収集しリスト化を行った。適宜PD-L1の免疫染色を追加でも病理組織を用いて行っており、これに関してはすべての情報がそろった状態とした。採血サンプル取得のため臨床試験の様式作成と患者説明・同意書作成を行い、倫理申請を行った。また準備段階での打ち合わせに時間を要したため進捗が計画より遅れているが、倫理申請承認後は同定している患者から説明・同意を得て採血サンプル採取後、病理サンプルとともにエピトープ解析が解析していく方針である。
今後の研究の推進方策	腫瘍および非腫瘍サンプルの全エクソームの塩基配列を解析術後症例では組織凍結標本より癌部および非癌部を採取し、mRNAを調整してcDNAを作成する。また進行症例では生検検体（癌部）と末梢血単核球成分（非癌部）より同様の調整を行う。ライブラリーを構築後、HiSeq(Illumina社)を用いてタンパク質コード遺伝子の全エクソームの塩基配列を解析する。非癌部由来cDNAの配列を参照配列とし、癌部由来の配列をマッピングして変異箇所の解析を行ってリスト化し、missense変異の箇所、数の情報を得る。同時に各患者のHLA genotype（正常組織）と腫瘍組織における発現を確認しておく。腫瘍由来T細胞エピトープのin silico探索全エクソン塩基配列の解析結果より、missense変異を含み、各HLA genotypeに結合しうる9アミノ酸からなるペプチドモチーフをプログラムしたソフトにて該当するmissense 変異およびその翻訳された変異peptideを探索する。因みにHLA-A0201とHLA-A2402は日本人においてアリルでは各11.6%、36.1%であり、ハプロタイプでは各約20％、70%であるため、本研究対象者の大半がこれらいずれかのHLA genotypeを有すると考えられる。抗PD-1療法の治療反応群患者群と治療非反応群について、missense変異の数、腫瘍由来T細胞エピトープ数を比較検討する。抗PD-1阻害療法における腫瘍縮小効果の有無とmissense変異数、候補となった腫瘍由来T細胞エピトープ数との関連を検討する。またmissense変異のうちsmoking signatureやAPOBEC関連変異群についても着目する。
次年度使用額が生じた理由	現段階では、計画に従って、まずこれまで千葉大学呼吸器外科で術後再発や進行期肺癌に対し免疫療法を行った患者のリストアップを行い、対象患者の同定を行い、患者背景や、使用した薬剤、効果、副作用等の詳細な臨床情報を収集しリスト化を行った。適宜PD-L1の免疫染色を追加でも病理組織を用いて行っており、これに関してはすべての情報がそろった状態とした。採血サンプル取得のため臨床試験の様式作成と患者説明・同意書作成を行い、倫理申請を行った。また準備段階での打ち合わせに時間を要したため進捗が計画より遅れているが、倫理申請承認後は同定している患者から説明・同意を得て採血サンプル採取後、病理サンプルとともにエピトープ解析が解析していく方針である。以上より現段階では、解析に必要な倫理審査や患者の背景のリストアップ、環境整備に時間を要したため、実際のサンプルを使用した解析には至っておらず、助成金が次年度に繰り越された。昨年計画分も含めて次年度で使用して時間的遅れを調整していく予定である。