| 研究課題/領域番号 |
17K10988
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
吉田 行弘 日本大学, 医学部, 講師 (20201022)
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| 研究分担者 |
安藤 隆 山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (10377492)
鈴木 良弘 一般社団法人プラズマ化学生物学研究所, 研究部, 代表理事 (80206549)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | PASS / サリノマイシン / 骨肉腫 / オートファジー / ミトファジー |
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| 研究実績の概要 |
骨肉腫細胞では通常の培養条件下でも多数の大きなオートファゴソーム斑点（CYTO-IDを用いて蛍光顕微鏡で検出）とオートファゴソーム形成マーカーLC3-IIの発現（ウエスタンブロッティングで検出）が観察された。これに対して、ヒト正常表皮線維芽細胞(HDF)ではオートファゴソーム斑点はほとんど見られず、LC3-IIの発現も検出されなかった。さらに、TRAILで処理するとオートファゴソーム斑点及びLC3-IIの発現は腫瘍細胞でのみ増加した。これらの腫瘍細胞ではTRAILによって細胞死が誘発されないことから、このオートファジーフラックスは細胞保護的な機能を持つと考えられた。この考えを検証するために３-メチルアデニン、クロロキン及びバフィロマイシンの細胞増殖に対する効果を調べたところ、これらは濃度依存的に細胞死を誘発し、PASSはこの作用を増強した。そこで、PASSのオートファジーに対する効果を調べた結果、PASSは骨肉腫細胞でオートファゴソーム斑点ならびにLC3-IIを減少させ、この自発的なオートファジーフラックスを抑制することが示された。一方、PASSはオートファジーフラックス抑制に関与するp70 S6キナーゼ、Rictor及び, Raptorのリン酸化を投与後30分から顕著に増加させ、その効果は240分まで持続した。このことからPASSはオートファジーフラックス抑制経路の活性化によってオートファジーを抑制していると考えられた。PASSによるミトファジーの誘発はHDFでは観察されなかったこと、TRAILはミトファジーの誘発を細胞種に関わらず誘発しなかったこと、及びPASSによるミトファジーの誘発と細胞死はサリノマイシンや３-メチルアデニンによってさらに増強されたことから、細胞保護的マクロオートファジーの抑制とミトファジー活性化が細胞死に関連していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
PASS による細胞死の機構に関しては細胞保護的マクロオートファジーの抑制とミトファジー活性化という新知見が得られこれまで報告されてきたアポトーシスとは異なる新しい機序の関与を明らかにしつつあり順調に進んでいる。オートファジーの分子レベル解析に注力したため本年度に行う予定であったPASS及びサリノマイシンのカルシウムシグナル解析は、予備検討までしか行えず本格的な実験・解析は最終年度に持ち越されることになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
別のPASS研究プロジェクトの結果、PASSは腫瘍細胞内に一酸化窒素を産生させ、この産生がPASSによる非アポトーシス型細胞死及びミトコンドリアネットワークリモデリングに関与することが明らかになってきた。そこで、今後PASS及びサリノマイシンの一酸化窒素産生に対する効果を検討する。また一酸化窒素はミトコンドリア内カルシウム動態を変調させるので、PASS及びサリノマイシンのカルシウムシグナル解析はミトコンドリア内カルシウムを中心に行ってゆく。前年度の成果からPASSとサリノマイシンの骨肉腫細胞死誘発における相乗効果にはミトコンドリアと小胞体の両方の変性が付随することが示唆されたのでミトコンドリア内カルシウムまたは一酸化窒素シグナルの変調がこれらのオルガネラの変性とどう関わっているかを解析してゆく。そのための方策として一酸化窒素に関しては、細胞内一酸化窒素ドナーまたは消去剤を使用し、またミトコンドリア内カルシウムに関しては、mitochondrial calcium uniporter、mitochondrial permeability transition pore及びsodium calcium exchanger等の活性を阻害して、PASS/サリノマイシン単独または併用投与による細胞死、ミトコンドリアネットワークリモデリング、マクロオートファジーの抑制及びミトファジー活性化に対する効果を検討する予定である。
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