| 研究課題/領域番号 |
17K10996
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
岡田 慶太 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (50759173)
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| 研究分担者 |
小林 寛 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (20407951)
齋藤 琢 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (30456107)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | HIF-1α |
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| 研究実績の概要 |
本年度は低酸素条件下に培養したHIF-1αを強制発現する軟骨細胞株を用いて軟骨保護作用の実験を行った。また初年度の実験を継続し、エピゲノム解析を行ったが、解析に耐えうる質の結果が得られず、条件検討しながら現在も継続中である。
これまで我々が行ってきたHIF-1α強制発現系のCHIPシークエンスの結果から、NF-κB シグナルを抑制する受容体や分泌タンパクを候補遺伝子としてピックアップし、軟骨に対する保護的作用をみた。3つの候補遺伝子まで絞り込み、ATDC5 細胞株を用いてそれぞれの作用を検証している。そのうち一つの分泌タンパクを制御することで保護的な作用を有することが分かった。その最も有力な候補遺伝子を、コンディショナルノックアウトマウスを用いて検証するための準備をしているが、現在、免疫染色などで局在を確認している。リコンビナントタンパクの購入、構造的活性型変異体、ドミナントネガティブ変異体を準備し、in vitroでの解析も進めている。特にIL1βを用いた実験で抗炎症作用を見ると、HIF-1αが過剰に発現することがわかり、同時に候補遺伝子の発現も増加していることが分かった。どちらが直接炎症によって惹起されるかも含めて、現在実験を進めている。また、来年度に行う実験の準備として、マウスでの2型コラーゲン抗体注射によって関節炎を惹起させるCollagen Antibody-Induced Arthritis （CAIA）モデルを検証している。これまでも当研究室で同様の実験行ってきたが、マウスの系統により炎症が惹起されないことがあり、現在所有しているHIF-1αのコンディショナルノックアウトマウスでの予備実験を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ChIPシークエンスの結果がまだ出ていないことから遅れているが、その他のデータを用いて候補遺伝子は絞り込まれており、それらの解析は順調に進んでいる。最終年の動物実験は繁殖能力が律速段階になりうるため、これまで以上に努力する必要がある。
これまでに得られた結果からは、当初予想していたより、多岐にわたる検証実験が行える遺伝子が同定できたため、今年度の実験はすで数多く走り始めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画通り、最終年はin vitroではHIF-1αがNF-κBシグナルを制御して軟骨に保護的に作用するメカニズムの解明に努める。具体的には、NF-κBシグナルを仲介するRelaなどの代表的な因子と候補遺伝子やHIF-1 α自体がどのように関わっているかをアゴニストやアンタゴニストを用いながら順番に調べていく。またこれまで結果が得られなかったエピジェネティックな制御のATACシークエンスや実験を同時に進めながら、in vivo の実験を行う。前年度に準備を始めたコンディショナルノックアウトマウスを用いたCAIA関節炎モデルでの候補遺伝子発現を解析するとともに、HIF-1α自体が、関節炎モデルでどのように発現するかを解析する。また、候補遺伝子が分泌タンパクであるため、リコンビナントタンパクが十分量入手できれば直接関節内に注射し、関節炎の制御を検証する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）順調に研究が進んでいるため、必要以上に経費をかけずに済んだ
（使用計画）in vivoの解析など、次年度以降の経費のかさむ実験に使用する計画である
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