| 研究課題/領域番号 |
17K11033
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| 研究機関 | 東邦大学 |
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研究代表者 |
中川 晃一 東邦大学, 医学部, 教授 (30400823)
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| 研究分担者 |
中島 新 東邦大学, 医学部, 准教授 (60583995)
玉田 靖 信州大学, 学術研究院繊維学系, 教授 (70370666)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 軟骨再生 / 滑膜細胞 / フィブロイン / 線維芽細胞増殖因子 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、遺伝子組換えカイコより精製した線維芽細胞増殖因子2（Fibroblast growth factor2, 以下FGF2）融合フィブロインを利用し、より層の厚い移植用ヒト滑膜細胞シートを作製することを目的としている。平成31年度は、29年度に決定した条件で作製した細胞シートを、30年度と同様に培養開始後１週目から200 ng/mlのrhBMP2を添加した軟骨分化誘導培地（DMEM high glucose, 1% ITS mix, 160μg/ml sodium pyruvate, 100 ng/ml dexamethasone, 0.2 mM Asc2-P, 10ng/ml TGF beta-3 ）に変更して培養した場合の軟骨分化についての再評価と、滑膜細胞を播種したFGF2融合フィブロインスポンジと細切軟骨片を共培養した場合の滑膜細胞層の軟骨分化の評価を行い、これらを比較した。生化学的検討として、滑膜細胞層をpapainにて酵素処理後、DNA量（ヘキストダイによる定量）、プロテオグリカン含有量（DMMB法）、コラーゲン含有量（HPLCによるハイドロキシプロリン量）を測定した。またRNAを抽出し、real-time RT-PCR法によるI, II 型コラーゲン、アグリカン、Sox9の遺伝子発現定量を行った。共培養開始時にはFGF2 融合フィブロイン群ではHE染色にて対照群と比較して厚い細胞層が形成されていたが、培養中に厚みの差がなくなる傾向にあった。サフラニン-O 染色、抗S100蛋白抗体および抗II型コラーゲン抗体を用いた免疫染色ではほぼ同等の染色性を示した。組織あたりのDNA量は軽度増加、プロテオグリカン含有量、コラーゲン含有量は同等ないしは軽度低下していた。II 型コラーゲン、Sox9発現量は同等であったが、アグリカン発現量は軽度低下していた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成29年度はヒト手術検体より採取した分離した滑膜細胞をフィブロインスポンジ上に播種して細胞シートを作製し、FGF2融合フィブロインの使用、および培養上清へのrhFGF2添加により滑膜細胞の増殖が促進されることが確認された。細胞増殖には個体差があったが、いずれの細胞においても細胞増殖効果が得られていた。平成30年度は前年度と同様の条件下でWild-type フィブロイン、FGF2 融合フィブロイン上で作製した細胞シートを、培養開始後１週目からrhBMP2入りの軟骨分化誘導培地に変更して培養し、軟骨分化についての評価を行った。FGF2 融合フィブロインの使用により細胞シートの厚さを増加させることはできるが、軟骨への分化誘導は抑制される可能性があることが示唆された。これらの結果は滑膜細胞を採取した個体により差がみられた。平成31年度はフィブロイン上で作製した細胞シートを細切軟骨片と共培養して滑膜細胞層の軟骨分化の評価を行った。FGF2 融合フィブロイン群では、HE染色にて対照群と比較して厚い細胞層が形成されていたが、培養中に細胞シートの厚みがやや減少する傾向がみられた。サフラニン-O 染色、抗S100蛋白抗体および抗II型コラーゲン抗体を用いた免疫染色では対照群と同等の染色性を示した。DNA量は軽度増加、プロテオグリカン含有量、コラーゲン含有量は同等ないしは軽度低下していた。II 型コラーゲン、Sox9の発現量は同等であったが、アグリカン発現量は軽度低下していた。これらの結果はrhBMP2を添加して軟骨分化誘導した場合とほぼ同様の結果であり、軟骨分化傾向は不変またはやや抑制される傾向があることが示された。前年度まで研究はほぼ予定通りに進んでいたが、細切軟骨片との共培養での軟骨分化誘導では、十分な厚みの細胞層が得られなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29～31年度の研究により、FGF2 融合フィブロイン上で作製したヒト滑膜細胞シートは、対照群と比較して厚くなるが軟骨分化誘導した際の分化がやや抑制される場合がある（個体差有り）と考えられた。特に細切軟骨片との共培養により軟骨分化誘導を行った場合には、培養の過程で細胞層の厚みもやや減少する傾向にあった。そこで、できれば軟骨分化誘導開始前の条件を再調整して、再度同様の実験を試みるのが望ましいと考えられた。研究費の残金もあったことから、補助事業期間を延長して追加実験を行うこととした。
平成29年度に行った予備実験から、線維芽細胞増殖因子融合フィブロインスポンジを用いた場合よりも、フィブロインスポンジを線維芽細胞増殖因子溶液に直接浸して用いた場合の方が、細胞層の厚みがより増すことがわかっているので、この条件で再度細切軟骨片との共培養による軟骨分化誘導を行ってみる方針とした。さらに、FGF2 融合フィブロインを使用することが細胞シートの軟骨分化に及ばす影響に関して、ヒト由来骨髄間葉系幹細胞株（RCB2163）を用いた検証も行っていく予定である。31年度と同様に軟骨分化誘導培地で培養し、滑膜細胞層の軟骨分化につき評価する。組織学的検討としては、HE、トルイジンブルー、サフラニン-O による染色と抗S100蛋白抗体および抗II型コラーゲン抗体を用いた免疫染色を行い、軟骨分化を評価する。生化学的検討として、滑膜細胞層をpapainにて酵素処理後、DNA量（ヘキストダイによる定量）、プロテオグリカン含有量（DMMB法）、コラーゲン含有量（HPLCによるハイドロキシプロリン量）を測定する。またRNAを抽出し、real-time RT-PCR法によるI, II 型コラーゲン、アグリカン、Sox9の遺伝子発現定量を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成29年度は細胞増殖に関する検討を中心に行い、培養期間が比較的短くて済んだため、ウシ胎児血清、細胞培養試薬、消耗品の使用量が予定より少なく、次年度使用額が生じた。平成30, 31年度は主に軟骨分化に関する評価を行うため培養期間が長くなり、前年度よりもウシ胎児血清、細胞培養試薬、消耗品の使用量が多くなるほか、ヒト由来骨髄間葉系幹細胞株RCB2163による条件検討を行うことで、予定よりさらに使用量が増えると予想されていた。しかし、ヒト由来骨髄間葉系幹細胞株RCB2163による実験がやや遅れて、使用料が予想より少なくなり、結果的に年度使用額が生じた。補助事業期間を延長し、繰越して使用することになった残金の826,316円は、細胞培養試薬、消耗品の購入、論文作成費用に使用する予定である。
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