遺伝子改変動物によるオキシトシン疼痛・炎症関連下行系の可視化・定量化の試み

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K11039
• 研究機関: 産業医科大学
• 研究代表者: 鈴木 仁士 産業医科大学, 医学部, 助教 (80644880)
• 研究分担者: 上田 陽一 産業医科大学, 医学部, 教授 (10232745)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: オキシトシン / 単量体赤色蛍光 / トランスジェニックラット / CRPSモデル / 坐骨神経部分結紮

研究実績の概要

成熟雄性オキシトシン（OXT）-単量体赤色蛍光タンパク1（mRFP1）トランスジェニックラットを用いて右側坐骨神経を部分結紮し、CRPSモデルを作成した。無処置群と偽手術群を対照群とし処置後７日に実験を行った。処置前後の痛覚閾値をvon Freyテストで確認したところ坐骨神経部分結紮群で有意に低下していた。その後、灌流固定し、脳および脊髄を採取した。下垂体後葉（PP）は採取後、蛍光顕微鏡を用いてmRFP1の発現を観察した。ホルマリン固定後、ミクロトームを用いて視索上核（SON）、室傍核（PVN）および第５腰髄（L5）脊髄後角を含む30μmの切片を作成。その後、免疫組織化学的染色法でFosタンパクを緑色蛍光で標識し、蛍光顕微鏡でSONおよびPVNにおけるmRFP1ならびにFosタンパクの発現を観察した。PVNは大細胞領域（mPVN）と小細胞領域（pPVN）に分けて検討した。さらに患側L5脊髄後角Ⅰ-Ⅱ層におけるmRFP1陽性分泌顆粒数を観察した。その結果、mRFP1平均輝度は観察した全ての領域で坐骨神経部分結紮群で対照群と比較し有意に増加していた。脊髄後角におけるmRFP1陽性分泌顆粒数も坐骨神経部分結紮群で有意に増加していた。処置後7日ではFosタンパクの発現は確認できなかったためmRFP1輝度の経時的変化を確認する事とし、処置後1日ならびに14日で同様の実験を行った。処置後14日の結果は全ての項目で処置後7日と同様だった。処置後1日の痛覚閾値は各群間で有意差を認めなかった。mRFP1平均輝度はPPで坐骨神経部分結紮群と偽手術群で無処置群と比較し有意に増加していた。SONおよびpPVNで坐骨神経部分結紮群で対照群と比較して有意に増加していたが、mPVNでは有意差を認めなかった。脊髄後角におけるmRFP1陽性分泌顆粒数は坐骨神経部分結紮群で無処置群と比較してのみ増加していた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

(平成 29 年度) は、OXT-mRFP1トランスジェニックラットを用いたCRPSモデルの実験を行い、視床下部および脊髄後角のOXT-mRFP1の赤色蛍光の可視化・定量評価を行った。Fosタンパクを指標に活性化したニューロンの確認を試みたが、処置後7日でFosタンパクの発現を認めなかったため処置後1日および14日の追加実験を行った。

今後の研究の推進方策

次年度（平成 30 年度）においては、実際にCRPSモデルにおいてOXT合成が増加していることを証明するために、OXTならびにmRFP1のmRNAが増加していることを確認する。OXT-mRFP1トランスジェニックラットを用いて処置後7日で断頭を行い、クリオスタットを用いて12μmの切片を作成しin-situハイブリダイゼーションを行う。
また、脊髄後角の抑制性介在ニューロンを抗 GABA 抗体もしくは抗 GAD 抗体による免疫組織化学的染色法を用いて緑色蛍光で可視化する。蛍光顕微鏡を使用し、脊髄後角Ⅰ-Ⅱ層における オキシトシン-mRFP1 蛍光陽性の分泌顆粒を含むオキシトシンニューロンの軸索が GABA もしくは GAD 陽性細胞に投射するか確認する。
本研究の成果は、日本生理学会、日本整形外科学会などの国内学会および国際学会に発表し、国際専門誌に英文論文として発表する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Radiologic Correlation Between the Ischiofemoral Space and Morphologic Characteristics of the Hip in Hips With Symptoms of Dysplasia (2018)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi Yasuo, Suzuki Hitoshi, Nakashima Hirotaka, Murata Yoichi, Matsuda Dean K., Sakai Akinori, Uchida Soshi
  • 雑誌名: American Journal of Roentgenology 巻: 210(3) ページ: 608～614
  • DOI: 10.2214/AJR.17.18465
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Endoscopic shelf acetabuloplasty can improve clinical outcomes and achieve return to sports-related activity in active patients with hip dysplasia (2018)
  • 著者名/発表者名: Uchida Soshi、Hatakeyama Akihisa、Kanezaki Shiho、Utsunomiya Hajime、Suzuki Hitoshi、Mori Toshiharu、Chang Angela、Matsuda Dean K.、Sakai Akinori
  • 雑誌名: Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy 巻: in press ページ: -
  • DOI: 10.1007/s00167-017-4787-0
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Arthroscopic Shoelace Side-to-Side Repair Technique Using Ultratape for the Treatment of Longitudinal Midsubstance Rotator Cuff Tears (2017)
  • 著者名/発表者名: Suzuki Hitoshi、Chang Angela、Kumagae Hiroto、Shimizu Yuki、Sakai Akinori、Uchida Soshi
  • 雑誌名: Arthroscopy Technique 巻: 6 ページ: e1845～e1850
  • DOI: 10.1016/j.eats.2017.06.058
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Arthroscopic Technique to Reduce Suture Button Migration During Anterior Cruciate Ligament Reconstruction Procedure (2017)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi Yasuo、Chang Angela、Utsunomiya Hajime、Suzuki Hitoshi、Nakamura Eiichiro、Sakai Akinori、Uchida Soshi
  • 雑誌名: Arthroscopy Technique 巻: 6 ページ: e1927～e1931
  • DOI: 10.1016/j.eats.2017.07.016
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Comparison of the induction of c- fos -eGFP and Fos protein in the rat spinal cord and hypothalamus resulting from subcutaneous capsaicin or formalin injection (2017)
  • 著者名/発表者名: Motojima Yasuhito、Matsuura Takanori、Yoshimura Mitsuhiro、Hashimoto Hirofumi、Saito Reiko、Ueno Hiromichi、Maruyama Takashi、Sonoda Satomi、Suzuki Hitoshi、Kawasaki Makoto、Ohnishi Hideo、Sakai Akinori、Ueta Yoichi
  • 雑誌名: Neuroscience 巻: 356 ページ: 64～77
  • DOI: 10.1016/j.neuroscience.2017.05.015
  • 査読あり
• [学会発表] オキシトシン-mRFP1トランスジェニックラットを用いた神経障害性疼痛モデルにおける中枢神経系生理活性について (2018)
  • 著者名/発表者名: 西村春来, 川崎展, 元嶋尉士, 鈴木仁士, 大西英生, 吉村充弘, 丸山崇，齋藤玲子，上野啓通，園田里美, 西村和朗, 田中健太郎，上田陽一，酒井昭典
  • 学会等名: 第13回環境生理学プレコングレス
• [学会発表] 複合性局所疼痛症候群の既往があり、膝関節後内側に再発した滑膜性軟骨腫症の鏡視下手術治療経験 (2018)
  • 著者名/発表者名: 高田真一朗, 畠山昌久, 鈴木仁士, 内田宗志
  • 学会等名: 第44回九州膝関節研究会
• [学会発表] Fluorescent visualization of oxytocin neurons activated by acute nociceptive stimuli in the c-fos-eGFP transgenic rats (2017)
  • 著者名/発表者名: Yasuhito Motojima, Haruki Nishimura, Takanori Matsuura, Mitsuhiro Yoshimura, Hirofumi Hashimoto, Reiko Saito, Hiromichi Ueno, Takashi Maruyama, Satomi Sonoda, Kazuaki Nishimura, Kentaro Tanaka, Hitoshi Suzuki, Makoto Kawasaki, Hideo Ohnishi, Akinori Sakai, Yoichi Ueta
  • 学会等名: Fourth World Congress of Reproductive Biology
  • 国際学会
• [学会発表] プロ・大学サッカー選手におけるfemoroacetabular impingement(FAI)と第5中足骨疲労骨折の関連 (2017)
  • 著者名/発表者名: 清水勇樹, 綿貫誠, 宇都宮啓, 林英俊, 熊谷達仁, 鈴木仁士, 内田宗志, 酒井昭典
  • 学会等名: 第９０回日本整形外科学会学術集会
• [学会発表] 膝離断性骨軟骨炎に対する保存療法の成績 (2017)
  • 著者名/発表者名: 上野仁豪, 鈴木仁士, 中島裕貴, 内田宗志
  • 学会等名: 第9回日本関節鏡・膝・スポーツ整形外科学会
• [学会発表] 上腕骨外上顆炎のECRBリリース術後に生じた後外側不安定症に対して、docking法を用いて後外側靭帯再建術を施行した治療経験 (2017)
  • 著者名/発表者名: 德田昂太郎, 鈴木仁士, 雪澤洋平, 大西康央, 熊谷達仁, 清水勇樹, 内田宗志
  • 学会等名: 第9回日本関節鏡・膝・スポーツ整形外科学会
• [学会発表] 外傷性肩関節脱臼に肩甲下筋腱断裂および上腕二頭筋長頭腱脱臼を伴った鏡視下手術治療経験 (2017)
  • 著者名/発表者名: 嵐智哉, 熊谷達仁, 本田英三郎, 鈴木仁士, 内田宗志
  • 学会等名: 第9回日本関節鏡・膝・スポーツ整形外科学会
• [学会発表] 寛骨臼形成不全症股（DDH）に発症したRim fracture(RF)に関節鏡視下整復固定術と鏡視下臼蓋形成術を行った3例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 清水勇樹, 雪澤洋平, 大西康央, 熊谷達仁, 鈴木仁士, 内田宗志
  • 学会等名: 第9回日本関節鏡・膝・スポーツ整形外科学会
• [学会発表] 股関節滑膜性脂肪腫症に対する股関節鏡視下手術の治療経験 (2017)
  • 著者名/発表者名: 西村春来, 鈴木仁士, 大西康央, 内田宗志
  • 学会等名: 第9回日本関節鏡・膝・スポーツ整形外科学会
• [学会発表] 体重200kg超級の相撲力士に対する鏡視下FAI手術の治療経験 (2017)
  • 著者名/発表者名: 雪澤洋平, 鈴木仁士, 清水勇樹, 熊谷達仁, 岩元俊樹, 德田昂太郎, 内田宗志
  • 学会等名: 第44回日本股関節学会学術集会
• [学会発表] Ischiofemoral space はFAI患者と比較して、DDH患者で有意に狭小化する (2017)
  • 著者名/発表者名: 大西康央, 中島裕貴, 鈴木仁士, 内田宗志
  • 学会等名: 第44回日本股関節学会学術集会