| 研究課題/領域番号 |
17K11058
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
水野 祐介 横浜市立大学, 附属病院, 准教授 (80433192)
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| 研究分担者 |
古賀 資和 横浜市立大学, 医学部, 助教 (00637233)
渡辺 至 横浜市立大学, 医学研究科, 客員教授 (20534142)
川上 裕理 横浜市立大学, 附属市民総合医療センター, 助教 (90407958)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | Protein kinase D / 血管収縮 / カルシウム / アクチン / MYPT1 |
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| 研究実績の概要 |
大動脈リング標本を用いたPKDの血管収縮における役割を以下のように検討した。
・ラット大動脈の血管張力におけるにおけるPKDの役割の検討
ラット大動脈リング標本を用いた等尺性張力測定では、norepinephrineによる収縮をPKD阻害薬 CRT006616は容量依存性に有意に抑制した。
・norepinephrine刺激下の血管リング標本における、PKDを介したpathwayについての検討
上記条件においてリング標本を収縮させた状態いおいて、液体窒素により瞬間凍結し、タンパク固定液内でホモジナイズし、リン酸化状態を固定した上でリン酸化状態をwestern blot assayにより測定した。norepinephrine刺激でPKDの活性化指標とされるPKDのリン酸化が亢進していた。また血管収縮関連タンパクであるMYPT1, CPI-17,myosin軽鎖のリン酸化が亢進したが、PKD阻害薬でMYPT1、myosin 軽鎖のリン酸化は阻害された。以上からnorepinephrin 刺激によるラッド大動脈収縮において、PKD活性化がMYPT1, myosin軽鎖リン酸化と関連していることが示唆された。
また、ラット生体の循環におけるPKDの役割を検討した。ラットを全身麻酔下に人工呼吸とし、体血圧・肺動脈圧、体・肺血管抵抗、心拍出量等の循環パラメーターを取得した。PKD阻害薬CRT006616の静脈内投与により、血圧、体血管抵抗は低下したが、心拍出量は変化なかった。以上より、PKD阻害薬は体血管収縮を阻害したことが疑われた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
29年度に予定していた大腿動脈リング標本を用いたPKDの血管収縮における役割の検討、およびPKDやパスウェイのリン酸化状態測定実験はほぼ計画通りに進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
平滑筋培養細胞を用い、PKD isoform 1,2,3 ノックダウンさせ,よりより選択的にPKDを抑制することで、収縮関連タンパクMYPT1, CPI-17、myosin軽鎖やHSP27、actin、細胞内カルシウム濃度等、関連するパスウェイを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ラット動脈リング標本を用いた実験において、実験条件の検討等に計画ほど時間、労力を取られず順調に進んだため、次年度使用額が生じた。生じた差額は、リング標本におけるリン酸化状態測定実験の実験数を増やすために使用予定である。更に、PKD活性をより選択的に抑制するため、siRNAを用いてPKDをノックダウンし、リング標本と同様にPKDを介したパスウェイを平滑筋培養細胞を用いて検討する予定だが、同一ターゲットに対する複数の異なるsiRNAを使用し、より実験の確実性を高めるために使用する。
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