| 研究課題/領域番号 |
17K11062
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| 研究機関 | 東京医科大学 |
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研究代表者 |
内野 博之 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (60266476)
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| 研究分担者 |
魚島 直美 東京医科大学, 医学部, 助教 (20792211)
西山 遼太 東京医科大学, 医学部, 助教 (60795607)
千々岩 みゆき 東京医科大学, 医学部, 助教 (80407080)
石田 裕介 東京医科大学, 医学部, 助教 (40805884)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | CypD KOマウス / MPT / オートファジー / メタボローム |
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| 研究実績の概要 |
本研究計画では、SAEの実態をCypD・MPTとSyvn・ERAD情報伝達系と細胞内のクリアランスシステムであるオートファジーとの連関解析から明確にするために①SAE発症における脳内代謝にミトコンドリア・CypDが果たす役割の網羅的解析を行う。第8-10週令の雄性C57B6 wildマウスをwild群とCypD遺伝子欠損(Ppif-/-)マウス(CypD KO群)を用いて回盲部結紮＋２回穿刺による（CLP）誘発敗血症性脳症モデル（SAEモデル）を作製する。モデル作製６、１８時間後（wild群とCypD KO群ともに各群3匹の動物を使用、また、各群のshamとして3匹ずつの動物を使用）に大脳のサンプリングを施行して5%(w/w)マンニトール水溶液10mlを添加し、懸濁し、メタノール800mlを添加する。さらに内部標準液500ml添加し30秒間vortexし、2,300xg、4℃ 5分間遠心して遠心上清350mlx2を限外濾過フィルタにて除タンパクして9,100xg4℃ 2～5時間遠心してpelletを5%(w/w)マンニトール水溶液10mlに懸濁しCE-TOFMSによる脳内代謝経路のメタボローム解析を行い、脳内ミトコンドリアCypD情報伝達系の脳内代謝経路への役割を網羅的に検討する予定であるが、現在まだCypD KOマウスの作成段階である。現在までに、すでに10匹のホモCypD KOマウスの作成に成功しており、今後交配を重ねて個体数を増やしていく段階である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
CypD KOマウスはJackson Lab より購入して系統維持している。このマウスは、CypD遺伝子のエクソン1～3、および、翻訳開始点上流 20 bpをネオマイシンカセットの挿入により欠失させたノックアウトマウスである。そのため、CypD KOマウス同士の交配により、系統維持を行う。このマウスは、ミトコンドリアの膜透過性亢進（MPT）を減弱させる表現型を有するためCypD遺伝子欠損(Ppif-/-)マウス(CypD KOマウス)を作製する。現在までCypD KOマウスを作成しており。10匹のCypD KOマウスの作成に成功している。８月までに実験に必要なCypD KOマウスを作成できるとの考えており、マウスの数が十分に揃った段階で実験を開始する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、CypD KOマウスの作成が進んでおり平成30年8月までに実験が開始可能と考える。まずは、CypD KOマウスの敗血症脳症における抵抗性を検討してメタボローム解析を始める予定である。CypD KOマウスを増やすことが出来れば効率的に研究を進めることが可能と考える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2017年度はCypDKOマウスによるメタボローム解析を予定していたがKOマウスの作成が遅れたため当初の必要な予算を下回り次年度使用額が生じた。平成30年度は、SAE誘発時の脳内ミトコンドリアCypDを介した脳内代謝経路のメタボロームによる網羅的解析を行う。第8-10週令の雄性C57B6 wildマウスをwild群とCypD遺伝子欠損(Ppif-/-)マウス(CypD KO群)を用いて回盲部結紮＋２回穿刺による（CLP）誘発敗血症性脳症モデル（SAEモデル）を作製する。モデル作製６、１８時間後（wild群とCypD KO群ともに各群3匹の動物を使用、また、各群のshamとして3匹ずつの動物を使用）に大脳のサンプリングを施行して5%(w/w)マンニトール水溶液10mlを添加し、懸濁し、メタノール800mlを添加する。さらに内部標準液500ml添加し30秒間vortexし、2,300xg、4℃ 5分間遠心して遠心上清350mlx2を限外濾過フィルタにて除タンパクして9,100xg4℃ 2～5時間遠心してpelletを5%(w/w)マンニトール水溶液10mlに懸濁しCE-TOFMSによる脳内代謝経路のメタボローム解析を行い、脳内ミトコンドリアCypD情報伝達系の脳内代謝経路への役割を網羅的に検討する。
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