ダイオキシン類介在性のアンドロゲン受容体変異体分解による去勢抵抗性前立腺癌の制御

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K11117
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 丸山 覚 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (80507591)
• 研究分担者: 篠原 信雄 北海道大学, 医学研究院, 教授 (90250422)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 前立腺癌 / ダイオキシン受容体 / 芳香族炭化水素受容体 / アンドロゲン受容体 / Indirubin

研究実績の概要

前立腺癌はホルモン非依存性となってもARを介した増殖の制御を受けており、この機構の解明によりさらなる癌の制御の可能性があると考えられる。さらに、上記ARの質的異常の代表例としてAR変異体、とくにARのリガンド結合領域を欠いた変異体であるARスプライシングバリアント（AR-V7 etc.）が新規ホルモン治療剤に対する抵抗性を獲得する機序に重要であることが近年示されつつある。
ARはダイオキシン受容体(AhR)によるユビキチン化により分解されることが報告されている。また、我々はARおよびAhRを発現する前立腺癌細胞株を用いてダイオキシン投与によるリガンド依存性の細胞株増殖制御につき研究を進めてきている。本研究はその延長として、AR変異体を直接分解することにより去勢抵抗性前立腺癌の増殖抑制をもたらし治療的効果につなげることを目的とするものである。
本研究では、種々のダイオキシン受容体リガンドによる前立腺癌細胞株に発現させたARスプライシングバリアント分解の程度、そしてその細胞株のin vitroおよびin vivoにおける増殖・浸潤・転移抑制効果を検討し、抑制効果を有するダイオキシン類の必要量および毒性（致死量）についての検討を行う。
これにより毒性の少ない内因性ダイオキシン受容体リガンド投与が去勢抵抗性前立腺癌の治療法につながることを確認したいと考えている。また投与法としてリガンド投与は遺伝子治療やワクチン療法などとは異なり、経口投与など簡便な方法でも効果があることも予想される。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

１．アンドロゲン受容体の転写活性
AhRを発現している前立腺癌株へARスプライシングバリアント（AR-V7）を発現させ、in vitroでの転写活性や増殖能を様々な条件で検討することを目的に発現細胞を作成した。しかしながらvectorの問題があり発現の程度は微弱であり、実験には不適当であると考えられ試行錯誤している状況である。ゆえにin vivoでの検討として、免疫不全マウスへの移植 (xenograft) も施行不可の状態である。今後は発現させる方法を変更して継続する予定である。
２．内因性ダイオキシン類のマウスへの投与（毒性の確認、致死量の推定）
上記内因性ダイオキシン類を投与量ごとにマウスに経口および経腹膜投与をおこない連日観察をおこなう予定であるが、時間と場所の問題で未施行である。本年度に開始する見込みである。

今後の研究の推進方策

1.内因性ダイオキシン類のマウスへの投与(毒性の確認、致死量の推定)
上記内因性ダイオキシン類をいくつかの投与量にふってマウスに経口および経腹膜投与をおこない連日観察をおこなう。各群n=5程度とする。これは新規大学院生とともに行う予定である。
2.アンドロゲン受容体の転写活性
AhRを発現している前立腺癌細胞株 (LNCaP, 22RV1) にARスプライシングバリアント（AR-V7）を強制発現させ、さらにMMTV-Lucを発現させ、ルシフェラーゼアッセイをおこなう。同時にsiRNAでAhRをknock downした細胞株も比較する。各条件の細胞株のAR-V7およびAhRの発現量(mRNA、タンパク)をそれぞれ定量的Real-time PCR法およびウエスタンブロット法で確認しておく。以上を、同様にDHTおよび各種内因性ダイオキシン類の有無、また添加量を変えて検討を行う。
３．前立腺癌細胞増殖、コロニー形成能、アポトーシス誘導能
上記AhR発現を増加もしくは低下させたAR-V7発現前立腺癌細胞株をマルチウエルプレートにて培養し、細胞数の計測（細胞増殖曲線の作成）とMTSアッセイ（２日ごとにOD490をルミノメーターにて測定）をおこなう。また、60mm培養皿上で0.4%アガロース軟寒天培地にて３週間培養し、直径0.1mm以上の形成コロニーを測定する。細胞死を定量的に解析するためにTUNEL 染色を行い、陽性細胞数を測定する。アポトーシス経路を特定するために、Caspaseの活性測定、同時にBcl-2, Caspase, (p-)IkBα, (p-)Akt, MAPK, STAT3といったアポトーシスおよびARシグナルに関連するkey moleculeの発現をウエスタンブロット法でチェックする。以上を、DHTおよび各種内因性ダイオキシン類の有無、また添加量を変えて検討を行う。

次年度使用額が生じた理由

昨年度予定していた実験を行わなかった為、次年度使用額が生じたが、今年度にその実験を予定しており予定通り執行する。

研究成果

• [雑誌論文] Nephrometry score correlated with tumor proliferative activity inT1 clear cell renal cell carcinoma. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kikuchi H, Abe T, Matsumoto R, Osawa T, Maruyama S, Murai S, Shinohara N.
  • 雑誌名: Urol Oncol 巻: 37 ページ: e19-301.e25
  • DOI: 10.1016/j.urolonc.2019.02.005
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] 転移巣に対する手術療法 (2018)
  • 著者名/発表者名: 丸山 覚、宮田 遙、松本 隆児、大澤 崇宏、安部 崇重、篠原 信雄
  • 雑誌名: 泌尿器外科 巻: 31 ページ: 694 -695
• [雑誌論文] 当院における転移性腎細胞癌に対するアキシチニブの治療成績 (2018)
  • 著者名/発表者名: 日下部,直久 , 大澤,崇宏 , 宮田,遥 , 菊地,央 , 松本,隆児 , 丸山 覚 , 安部崇重 , 篠原信雄
  • 雑誌名: 泌尿器科紀要 巻: 64 ページ: 353 - 358
  • DOI: 10.14989/ActaUrolJap_64_9_353
• [雑誌論文] The usefulness of testosterone administration in identifying false-positive elevation of serum human chorionic gonadotropin in patients with germ cell tumor. (2018)
  • 著者名/発表者名: Takizawa A, Kawai K, Kawahara T, Kojima T, Maruyama S, Shinohara N, Akamatsu S, Kamba T, Nakamura T, Ukimura O, Jikuya R, Kishida T, Kakimoto K, Nishimura K, Harabayashi T, Nagamori S, Yamashita S, Arai Y, Sawada Y, Sekido N, Kinoshita H, Matsuda T, Nakagawa T, Homma Y, Nishiyama H.
  • 雑誌名: J Cancer Res Clin Oncol 巻: 144 ページ: 109-115
  • DOI: 10.1007/s00432-017-2520-5
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] Outcome and prognostic factors in metastatic urothelial carcinoma patients receiving second-line chemotherapy: an analysis of real-world clinical practice data in Japan. (2018)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto R, Abe T, Ishizaki J, Kikuchi H, Harabayashi T, Minami K, Sazawa A, Mochizuki T, Akino T, Murakumo M, Osawa T, Maruyama S, Murai S, Shinohara N.
  • 雑誌名: Jpn J Clin Oncol 巻: 48 ページ: 771-776
  • DOI: 10.1093/jjco/hyy094
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] Comparative study of lymph node dissection, and oncological outcomes of laparoscopic and open radical nephroureterectomy for patients with urothelial carcinoma of the upper urinary tract undergoing regional lymph node dissection. (2018)
  • 著者名/発表者名: Abe T, Kondo T, Harabayashi T, Takada N, Matsumoto R, Osawa T, Minami K, Nagamori S, Maruyama S, Murai S, Tanabe K, Shinohara N.
  • 雑誌名: Jpn J Clin Oncol 巻: 48 ページ: 1001-1011
  • DOI: 10.1093/jjco/hyy128
  • オープンアクセス