研究課題
人工ヒト腹膜組織を用いてCarbonyl reductase 1 (CR1)の発現程度によってヒト卵巣癌細胞の動態がどのように変化するのか検討することを目的とした。CR1-DNAを導入して強発現させたHRA細胞（ヒト漿液性卵巣癌細胞），CR1-siRNA導入によって発現を低下させたHRA細胞，遺伝子導入を行わなかったHRA細胞（コントロール）の3種類を人工ヒト腹膜組織に播種させ，癌性腹膜炎形成までの過程を6，24，48，72時間後と経時的に観察した．またTUNEL法，電子顕微鏡を用い，コントロール群，CR1-DNA導入群，CR1-siRNA群の人工腹膜組織上のアポトーシス細胞を比較した．培養細胞を用いて，1) フローサイトメトリーでアポトーシス細胞の割合，2) Ki-67陽性細胞数，3) ウエスタンブロット法でcaspase-3の発現強度を比較した．6時間後では，コントロール群，CR1-DNA導入群，CR1-siRNA群いずれも癌細胞の中皮への接着には差を認めなかった．24時間以降では中皮下に侵入した後の細胞増殖が，CR1-DNA導入群では他の2群に比べて有意に抑制されていた．48時間後では，CR1-siRNA群で細胞増殖が有意に亢進しており，72時間後ではCR1-siRNA群で癌細胞の間質への浸潤を認めた。CR1-DNA導入群で有意なアポトーシス細胞の増加を認め，電子顕微鏡でアポトーシス小体が確認された．培養細胞ではCR1-DNA導入群でアポトーシス細胞の有意な増加が確認された．また，CR1-siRNA群ではKi-67陽性細胞が有意に発現していた．caspase-3はCR1-DNA導入群で発現が増加しCR1-siRNA群では発現が低下していた．CR1の発現程度による腫瘍増殖の差を，in vitro組織モデルである人工ヒト腹膜組織でも同様の結果を得ることができた．
2: おおむね順調に進展している
平成30年度の目標は、癌細胞の接着、増殖と浸潤、脈管浸潤の各過程における癌細胞の挙動、微小環境の変化をリアルタイムで追跡するために、人工腹膜の断片を連日作製し、HE染色、電子顕微鏡で観察することとした。その一方で、癌細胞のコロニー形成前からCマウントCCDカメラを搭載した顕微鏡で癌細胞の広がりを連続撮影する。すなわち、腹膜組織に対して癌細胞の縦軸方向広がり、横軸方向の広がりを同時に観察する。以下の条件の細胞で腹膜転移過程を観察することであった。具体的には①HRA細胞の腹膜転移過程、②HRA細胞にCBR1 DNA-PAMAMデンドリマー複合体を48時間毎に添加した場合の腹膜転移過程、③コントロールとしてHRA細胞にPAMAMデンドリマーのみ48時間毎に添加した場合の腹膜転移過程、④CBR1 DNA導入HRA細胞の腹膜転移過程、⑤CBR1 siRNA導入HRA細胞の腹膜転移過程、の検討である。平成30年度の研究では、CR1を強発現，発現低下させても卵巣癌細胞はいずれも中皮への接着には影響しなかったが，CR1発現の程度は中皮下での増殖，浸潤に作用していた．すなわち、CR1を強発現させると細胞増殖は抑制され，CR1を発現低下させると細胞増殖は亢進され間質への浸潤も認めた．これは，先行研究のマウスin vivoの実験と同様の結果であった．また，TUNEL法，電子顕微鏡の結果からCR1の腫瘍抑制効果にはアポトーシスが関与していることが今回の結果から示唆された．またCR1発現低下群では，Ki-67陽性細胞が増加していたことより腫瘍増殖能の亢進も獲得していると考えられるという研究成果が得られ、一定の成果が得られたと思われる。
CBR1 DNA導入卵巣癌細胞の腫瘍増殖は抑制され、CBR1 siRNA導入細胞では腫瘍増殖、転移とも活発になる。 CBR1 の作用としては、アポトーシスの誘導と血管新生因子の不活化を通して腫瘍増殖を抑制することを申請者は証明してきた。その一方で、CBR1 強発現細胞では腫瘍細胞と間質細胞に貪食細胞に対するeat-me signal であるMilk fat globule EGF factor 8 (MFG-E8)が強発現しており、これはコントロール群では認められなかった現象である。低分子であるアミノ酸、有機酸、脂肪酸を含めた低分子の代謝産物をメタボローム解析によって解析することは、CBR1 投与後の癌細胞内の変化のみならず生体機能の変化の理解となる。1)CBR1 発現の多寡による癌細胞内での低分子代謝産物の変化①卵巣癌細胞HRA、②CBR1 DNA 導入HRA、③CBR1 siRNA 導入HRA の3 者間の低分子代謝産物のメタボローム解析を行い、腫瘍増殖との関連のある代謝産物を考察する。2)CBR1 DNA を静脈内投与した場合の生体機能の変化ヌードラットを用いて、①CBR1 DNA-PAMAM デンドリマーを静脈内投与後48 時間で採血を行う、②デンドリマーのみ静脈内投与後48 時間で採血を行う。血中の低分子代謝産物の変化を調べ、アミノ酸、有機酸、脂肪酸の生体機能の変化について検索する。
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