| 研究課題/領域番号 |
17K11491
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
須藤 則広 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (80646216)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 網膜発生 / 転写制御 |
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| 研究実績の概要 |
網膜ミュラー細胞は網膜前駆細胞と転写因子の発現が極めて類似しており、成体幹細胞と考えられているが、哺乳動物においてほとんど再生能は示さない。その理由はミュラー細胞における多分化能や神経分化に関わる遺伝子カスケードの消失にあるのではないかと推測している。本研究では網膜前駆細胞とミュラー細胞に共通して発現している転写調節因子（転写因子）を選びその標的遺伝子およびエンハンサーの変化について、エピジェネティクス修飾と相関させて網羅的に解析を行うことを計画している。
昨年度立ち上げたChIP-seq解析について、様々解析プログラムを利用し、パラメータを変えるなど最適なピークを得られるよう検討を行った。さらにこの解析で得られたピークがプロモーターやエンハンサー領域で示すためには、エピジェネティクス修飾を重ねて示す必要がある。エピジェネティクス修飾に関しては全ての細胞で修飾が見られるためミュラー細胞特異的な修飾を明らかにする為には細胞を単離して解析を行う必要がある。このミュラー細胞の分離について、これまでコスト面なども考慮し、磁気ビーズカラムによる単離方法を試みてきたが好ましい結果が得られていない。そこでセルソーターを用いた分離方に切り替えることにした。セルソーターは東京大学医科学研究所FACSコアラボラトリーの協力をえて現在進行中であったが、コロナウイルスに伴う利用中止の為、再開を待って実験を再始動させる予定である。
また本年度は、校舎移転（令和2年2月から５月）に伴い申請者は準備委員として参画していた為、移転一年前の本年度は特に忙しく、実験時間を十分に確保できていない。さらに研究室の移転準備や片付けに伴う実験中断もあり研究期間の延長が必要と判断し、申請を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ChIP-seq解析を進めるにあたり、磁気ビーズを用いたMACSによる細胞分離を進めていたが良い条件が定まらなかった。その為網膜前駆細胞とミュラー細胞だけで発現し、細胞分離の必要ないlhx2とsox9遺伝子に絞って解析を始めた。また当初胎生期の網膜前駆細胞を先に始める予定であったがより細胞数が多い生後1日目の網膜前駆細胞を含む網膜と3週齢網膜を用いてChIP assayを行い、先に得られた網膜前駆細胞クロマチンによるSox9抗体でのChIP-seq解析でペアエンドで4千万リードのデータを得た。シークエンスは外部委託し、得られたデータは複数のプログラムやクラウドなども利用しより最適なピークを得られるよう試行錯誤を行った。自前で解析できるようになったことは今後の研究の進展において大きな前進であり、経費削減にも大きく貢献するものである。細胞分離に関してはセルソーターの利用を試みており、分離できるようになればエピジェネティクス修飾によるChIP-seq解析が可能となる。
マウス網膜の損傷ではミュラー細胞は細胞周期に再進入しないが、未損傷網膜を培養系に移すと細胞分裂を開始することが知られている。この現象はマウスが幼若なほど顕著であり成体網膜では大きく減少するが、成体網膜でも一部分裂するミュラー細胞が存在する。しかしその過程がどのように起こっているかについては明らかではなく、この過程が生体網膜再生に応用できれば本研究の遂行に有用な情報となる為、継続して解析を行った。その結果iPS遺伝子のoct4、c-myc、sox2およびnanogが培養開始後から増加する結果が得られた。その為分化したミュラー細胞がリプログラムすることで増殖できるようになっていることが推測された。上記結果は生体内では網膜組織が成熟するほどリプログラム関連遺伝子が動きにくくなっている可能性示していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
まずは生後網膜前駆細胞と成体ミュラー細胞におけるsox9、lhx2のChIP-seq解析を先行して進める。次に得られたChIP-seqのピークがエンハンサーやプロモーター領域であることを示すためにH3K27ac（エンハンサー）やH3K4me3（プロモーター）などエピジェネティクス修飾は最低限明らかにする必要がある。その為、細胞分離はセルソーターによる分離条件を早急に解決しなければならいが、コロナウイルスによる影響で機器の使用ができないので、利用が再開し次第すぐに取り掛れるように準備をしておく。当初予定していたRNA-seq及びヒストン修飾、rax、pax6、chx10遺伝子のChIP-seq解析はミュラー細胞が分離できた段階で時間等を考慮して検討する。
上記の結果をもとに、転写因子の転写ネットワークモデルを構築する。本解析では胎生期網膜前駆細胞、生後網膜前駆細、ミュラー細胞の比較を通して、網膜前駆細胞の分化能が限局される過程およびミュラー細胞の成熟過程それぞれにおける転写制御ネットワークの遷移も解析可能だと考えているが、最低限、生後網膜前駆細、ミュラー細胞を比較することでも解析が可能である。またエンハンサーの活性の真偽についてもレポータアッセイやChIP-qPCR等の検証を加える予定である。さらに初代培養における細胞周期の再進入に関わる遺伝子を絞り込み、これら遺伝子がミュラー細胞においてH3K9me3（永続的抑制）、H3K27me3（一次的抑制）のどちらで修飾されているのか検討してみたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
校舎移転に伴う実験中断の為、研究期間の延長を行った。使用計画は当初の計画通りChIP-seq解析を行う予定である。
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