2017 年度実施状況報告書

単純口腔粘膜上皮細胞移植法の家兎モデルでの検討と臨床応用

研究課題

研究課題/領域番号	17K11492
研究機関	日本大学
研究代表者	山上聡日本大学, 医学部, 教授 (10220245)
研究分担者	崎元暢日本大学, 医学部, 准教授 (20465272)
研究期間 (年度)	2017-04-01 – 2020-03-31
キーワード	口腔粘膜 / 角膜上皮幹細胞疲弊症
研究実績の概要	これまで角膜上皮幹細胞疲弊症に対し、培養自己輪部上皮、培養自己結膜上皮、口腔粘膜上皮細胞シート移植を臨床で行って来た。しかし再生医療新法が厳格に適用され、非常に高いコストと膨大な申請書類を必要とするため再生医療の実施が困難になっている。このような現状を背景として、再生医療にかわる新たな移植法として、両眼性の角膜上皮幹細胞疲弊症に対し自己の結膜上皮細胞を移植する方法の臨床応用を行ってきた。今年度はさらに難治性の眼表面疾患に対して、再生医療によらない自己口腔粘膜上皮細胞移植の有効性を明らかにしていくことを目的とした研究を行った。再生医療にかわる新たな移植法として、両眼性の角膜上皮幹細胞疲弊症に対し自己の再生医療によらない自己口腔粘膜上皮細胞移植の有効性を明らかにする検討を行った。まず家兎を用いて口腔粘膜を採取し、幹細胞を含むか否かを検討した。家兎の頬部より粘膜を採取した。容易に剥離可能な上皮層とその下の基底層に分けてそれぞれを培養したところ、上皮層からの細胞増殖はなく基底層の細胞のみ増殖し、口腔粘膜上皮に特異的なCK3とCK13陽性細胞であることが確認された。結果として、移植に用いる細胞は粘膜上皮の基底層であることが明らかなとなった。次に家兎角膜上皮幹細胞疲弊症モデルを用いて自己口腔粘膜上皮移植を行った。検討群は、基底膜として羊膜使用の有無、接着材料としてフィブリン糊の使用の有無などで検討を行ったところ、羊膜もフィブリン糊の両方を用いない群で最も上皮の形成が良好であることが明らかとなった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由難治性の眼表面疾患に対して、再生医療によらない自己口腔粘膜上皮細胞移植の有効性を明らかにしていくことを目的とした研究を行ってきた。結果として家兎を用いて口腔粘膜を採取し、幹細胞を含むか否かを検討したところ、移植に用いる細胞は粘膜上皮の基底層であることが判明した。更に家兎角膜上皮幹細胞疲弊症モデルを用いて自己口腔粘膜上皮移植を行ったところ、羊膜もフィブリン糊の両方を用いない群で最も上皮の形成が良好であることが明らかとなった。このように動物実験においては、途中で新たな課題が生まれたがこれらを順調に克服し概ね進展していると考えられる。
今後の研究の推進方策	これまでは家兎を用いた検討を行ってきたがヒトの口腔粘膜を用いた検討はまだ行っていない。そこで今後はヒトの口腔粘膜を採取し、移植に最適な条件を明らかにするなどの検討を行う予定である。具体的には、口腔外科に協力をいただき抜歯時の余剰の歯根部組織を用いて、ヒト口腔粘膜の検討を実施する。得られるヒト口腔粘膜上皮を用いて家兎での酵素の種類、濃度、反応時間のデータを元にディスパーゼ、EDTA、トリプシンによるヒト口腔粘膜幹細胞採取法の再検討を行い、幹細胞を含んだ口腔粘膜上皮採取の最適の条件を決定する。獲得された口腔粘膜上皮と上皮下組織の組織学的検討を行い、上皮組織の剥離状態を検討する。剥離上皮で培養を行い、分化型マーカーや未分化マーカーでの染色を行い、眼表面再建を維持する因子の確認を行うなどより一層臨床に近づけるための検討を予定している。