| 研究課題/領域番号 |
17K11501
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立成育医療研究センター |
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研究代表者 |
田中 卓 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 視覚科学研究室, 研究員 (20443400)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 網膜分化 / 黄斑 |
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| 研究実績の概要 |
マイクロアレイ解析で網膜周辺部と黄斑部との間で顕著な発現差を示した遺伝子(黄斑変動遺伝子)について、発現、機能の観点からデータ解析を実施した。発現については生後の月数に違いのあるサンプル間での比較解析、iPS細胞から分化誘導した網膜細胞での発現解析を実施した。機能についてはGene Ontology(GO)解析を実施し、黄斑の特徴との関連が示唆されるいくつかのGOが付いた遺伝子が多くを占めていることが判明した。またマイクロアレイ解析に用いたサンプルを使用してRNA-Seq解析を実施し、データマイニングにより黄斑変動転写産物を抽出した。一連の解析で新たに非コードRNAの黄斑変動遺伝子が見つかり、スプライシングアイソフォームに対象を広げて黄斑変動転写産物の選別を進めている。黄斑変動遺伝子が関与するパスウェイ解析や遺伝子発現ネットワーク解析にも着手しており、複数の観点から黄斑変動遺伝子と黄斑形成とのつながりを探索していく計画である。
黄斑変動遺伝子と黄斑形成との関連を調べるための主要解析系としてiPS細胞からの網膜細胞への分化誘導系を予定している。網膜細胞への分化誘導系は既に構築しているが、分化誘導中の遺伝子発現抑制、外来遺伝子発現を行うため、siRNA、プラスミドの胚様体へのトランスフェクションの検討実験を行った。また視細胞の発現を可視化して、リアルタイムで追跡するため、ヒトiPSのゲノム編集実験を開始した。まだ条件検討の段階であるが、最終的に視細胞マーカー遺伝子の後にGFPをノックインしたiPS細胞を作成し、黄斑変動遺伝子が与える影響を調べていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
検体網膜の周辺部と黄斑部のトータルRNAを使用したマイクロアレイ解析、RNA-Seq解析によるトランスクリプトームのデータ収集は完了した。現在、データマイニングを行っている途中であり、黄斑の形成、特徴および黄斑疾患との関連が示唆される黄斑変動遺伝子はいくつか得られた。しかし最終的な黄斑変動遺伝子の選別には至らず、計画で予定していたヒト網膜分化誘導系を使用した黄斑変動遺伝子の解析は実施できなかった。黄斑変動遺伝子のスクリーニングと並行して、検証実験に必要なiPS細胞実験の検討は開始したが、黄斑との関連の評価に適用するために解決すべき技術的な問題点が残っており、引き続き検討が必要な状況にある。
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| 今後の研究の推進方策 |
黄斑変動遺伝子の選定が完了次第、計画どおりiPS細胞の網膜分化誘導系を使用した検証実験に着手し、黄斑とのつながりを明らかにしていく。iPS細胞のゲノム編集や誘導過程の遺伝子抑制、遺伝子導入は効率が比較的低く、多くの遺伝子を解析する場合、難航が予想される。評価する黄斑の機能、特徴に即して、網膜由来の細胞株など技術的な障害が比較的低い系での解析も導入していく予定である。
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