三次元培養皮膚におけるエクリン汗腺の再現

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K11542
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 亀田 健治 愛媛大学, 学術支援センター, 助教 (60363264)
• 研究分担者: 村上 正基 愛媛大学, 医学系研究科, 准教授 (20278302) ; 森 秀樹 愛媛大学, 医学系研究科, 講師 (60325389)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 三次元細胞培養 / エクリン汗管細胞 / 再生医療

研究実績の概要

我々は、再生医療を推進するため、これまで、三次元培養皮膚の作製法の研究を行なってきた。すなわち、羊膜を併用して三次元培養皮膚を作製することで、簡便に三次元培養皮膚を作製できる方法を確立し、報告している。培養皮膚の作製法はここ数年である程度の確立を認め、熱傷などに対する保険適応治療として、ベンチャー企業などからも患者角化細胞を用いた培養表皮が供給されるようになり、これによる自家移植が可能となった。しかしながら未だ三次元培養皮膚内での付属器の再生には至っておらず、今後マウスモデルに代わる実験モデルを目指す上で、表皮及び真皮内に付属器を再現することは非常に重要な課題である。我々は三次元培養皮膚内にエクリン汗腺の構築を試みる。
エクリン汗腺由来細胞（NCL-SG3細胞、臨床材料より分離した真皮内汗管細胞・腺房細胞）が幹細胞としての増殖能力を有しているかについて明らかにする。また、角化細胞、脂肪細胞、骨分化誘導培地などに変更し、多分化能を有するかについて検討する。分離培養された真皮内汗管細胞・腺房細胞を長期間培養し、その培養条件を適切な時期に変更し、さらに細胞成長因子などを添加する方法や、conditioned mediumを用いる方法、さらには角化細胞あるいは線維芽細胞との共培養の系を用いることで表皮内汗管、真皮内汗管へ分化誘導する系を確立する。これら汗腺細胞とI型コラーゲンゲルを用いて真皮成分の再構築を行い、真皮内で汗管・腺房への分化を誘導できるか検討する。作成された培養皮膚が正常皮膚とどの程度近似しているかについては形態学的、免疫組織学的に確認する。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

現在、エクリン汗腺由来細胞のゲル内での真皮内汗管への分化誘導と分化誘導したエクリン汗腺組織を用いた三次元培養表皮の作製を試みている。
コロニー形成を認める汗腺由来細胞を用いて、ゲル内でエクリン汗腺組織の包埋培養を行った。Base gelとupper gelの間に汗腺コロニーを挟み込み、その上からoverlay mediumを注ぎ、37℃・5%CO2 incubator内で培養した（mediumのみ3日毎に交換）。その後、ブタ腱由来Ⅰ型コラーゲン液に脂肪由来間葉系幹細胞を加えてカルチャーインサートに添加し、ゲル化させ、10%FCS/DMEMを適量インサートの内と外に添加し、５日間5%CO2, 37℃で培養した。ゲルの表面あらかじ培養しておいた汗管コロニー形成のみられるエクリン汗腺由来細胞を表皮角化細胞と共培養として播種する。３日間培養後、空気曝露を行い重層化させた。正常な表皮及び表皮内汗管が構築されていれば、経時的にサンプルを回収し、HE染色、免疫染色、電子顕微鏡にて検索する予定であるが、細胞培養が不安定であるため、まだ、再現性良くデーターが取れていない。今後、細胞培養条件を検討したいと思っている。

今後の研究の推進方策

再生医療における三次元培養皮膚エクリン汗腺由来細胞のゲル内培養は非常に重要である。我々の研究は、エクリン汗腺組織を用いた真皮内汗管への分化誘導を目的としている。
コロニー形成を認める汗腺由来細胞を用いて、エクリン汗腺組織がゲル内において再現性良く構築できる条件を検索している。すなわち、Base gelとupper gelの汗腺コロニーを挟み込みのタイミングとゲル化の条件を検討する。10%FCS/DMEMを内と外に添加し、ゲルの表面にあらかじ培養しておいた汗管コロニー形成のみられるエクリン汗腺由来細胞を表皮角化細胞と共培養したのち、空気曝露を行い重層化させた。正常な表皮及び表皮内汗管が構築されていれば、経時的にサンプルを回収し、HE染色、免疫染色、電子顕微鏡にて確認する。具体的にはHE染色にて形態学的な特徴を解析し、免疫染色にて基底膜構成成分のマーカー(laminn 5, type IV collagen, type VII collagen, integrin)、細胞間接着因子のマーカー(E-cadherin, desmoglein 1, 3)、細胞骨格のマーカー(keratin 5, 14, 10)、分化マーカー(involucrin,loricrin,transglutaminase)、汗腺マーカー(CEA, GDCFP-15)などの発現の比較を試みる予定である。

次年度使用額が生じた理由

昨年度も、新型コロナウイルスの影響により、研究が予想以上に進まなかった。再度、エクリン汗腺由来細胞のゲル内での真皮内汗管への分化誘導の検討と分化誘導したエクリン汗腺組織を用いた三次元培養表皮の作製について再検討する。

研究成果

• [雑誌論文] The SUN2-nesprin-2 LINC complex and KIF20A function in the Golgi dispersal (2021)
  • 著者名/発表者名: Hieda Miki、Matsumoto Taizo、Isobe Mari、Kurono Sadamu、Yuka Kaneko、Kametaka Satoshi、Wang Jing-Ya、Chi Ya-Hui、Kameda Kenji、Kimura Hiroshi、Matsuura Nariaki、Matsuura Shuji
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 11 ページ: 5358 5370
  • DOI: 10.1038/s41598-021-84750-4
  • 査読あり