| 研究課題/領域番号 |
17K11631
|
|---|
| 研究機関 | 日本歯科大学 |
|---|
研究代表者 |
佐藤 かおり 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (90287772)
|
|---|
| 研究分担者 |
田谷 雄二 日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (30197587)
白子 要一 日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (50756377)
添野 雄一 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (70350139)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | 歯学 / 病理学 / マウス顎顔面発生 / リンパ管形成 / リンパ管内皮細胞 / ガイダンス因子 / 細胞遊走 / microRNA |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究では、主静脈を起点として遠隔の下顎突起までのリンパ管内皮細胞の移住とその誘導に関わるガイダンス機構の解明を目的として、移住経路近傍の諸細胞およびゴールとなる下顎突起内の細胞等から発せられるガイダンス因子とその分子制御の仕組みを明らかにする。これらの制御因子を発現する細胞を特定するとともに、リンパ管内皮細胞との位置関係と組織内局在の解析によりリンパ管内皮細胞を中心とした細胞間の連携ネットワークを究明する。
初年度においては、マウス胎仔の顎顔面領域での多重免疫染色と組織立体構築法による解析を対象とする胎生時期の追加を含めて再度行い、(1) 顎顔面領域のリンパ管内皮細胞の起源は体幹部主静脈であること、(2) 体幹部主静脈で分化したリンパ管内皮細胞は出芽・遊走し、顎顔面領域まで決まった経路を辿って移動すること（図２）、(3) 顎顔面領域のなかで下顎突起に最も早く到達すること（E10.5）、(4) 下顎突起を含む顎顔面領域では、リンパ管内皮細胞同士が接着し（E11.5）、リンパ嚢形成（E12.5～13.5）を経て、管腔を有するリンパ管が形成されること（E14.5以降）を確認するとともに、詳細な観察と記述を行った。
さらに、移住途上にあるリンパ管内皮細胞と体幹部や下顎突起内の細胞との相互作用に働く新規のガイダンス因子候補を網羅的に列挙するために、ICRマウス胎仔（E9.5～11.5）のリンパ管内皮細胞の下顎突起までの移住経路において、リンパ管内皮細胞を含む領域の組織を採取し、DNAマイクロアレイ、ならびにmicroRNAマイクロアレイの解析を行った。IPA等を使ったデータ処理を行い、発現プロファイルを作成している。これらの分析結果はリアルタイムRT-PCRによりガイダンス因子と受容体（Cxcl12、Cxcr4を含む）とマイクロアレイ解析で新たに抽出された分子種の遺伝子・microRNA発現の検証を行っている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度では、マウス胎仔の顎顔面領域での多重免疫染色と組織立体構築法による解析を対象とする胎生時期の追加を含めて再度行うことによって、顎顔面領域のリンパ管内皮細胞の起源や移住経路、顎顔面領域でのリンパ管の形態形成の過程を詳細に解析することができた。このことによって、今まで明らかにできていなかった部分の記述を明確にすることができた。たとえば、体幹部主静脈から遊走を開始したリンパ管内皮細胞は胎生10.5日では下顎突起の入り口付近、胎生11.5日では下顎突起の先端部近くまで遊走していることが突き止められた。注目される事実として、顎顔面領域でのリンパ管形成では、体幹部に形成されたリンパ管から分枝して顎顔面領域に挿入してくるのではなく、個々に移住したリンパ管内皮細胞が凝集→ リンパ嚢形成→ 管腔を有するリンパ管の形成の過程を経て発生することが明らかとなった。
本申請課題の主たる目的であるリンパ管内皮細胞が的確に顎顔面領域に移住するためのガイダンス因子候補を探索するための最初のステップであるDNAマイクロアレイ、ならびにmicroRNAマイクロアレイの解析を予定通り行うことができた。現在、分析結果として発現プロファイルの作成と遺伝子発現の検証を継続している。これらの解析から、Gene Ontology、パスウエイ解析、ヒートマッピングはほぼ完了した。個々の遺伝子発現プロファイリングの整理もできており、有力なガイダンス因子候補の列挙を行っているところである。
|
| 今後の研究の推進方策 |
来年度以降、移住途上にあるリンパ管内皮細胞と体幹部や下顎突起内の細胞との相互作用に働く新規のガイダンス因子候補を網羅的に列挙するために行ったDNAマイクロアレイ、ならびにmicroRNAマイクロアレイの解析からの発現プロファイルの作成と遺伝子発現の検証を継続するとともに、多重免疫組織化学等によるタンパク質レベルの分析と組織内局在を明らかにする。さらに、静脈内皮細胞Endomucin、血管内皮細胞Pecam1の抗体、線維芽細胞S100A4、神経軸索NFP, GAP43、上皮細胞pan-Cytokeratin、筋前駆細胞Desmin等の特異抗体を使用して、ガイダンス因子を発現する細胞種の同定とリンパ管内皮細胞（Prox1/ Vegfr3またはProx1/ CoupTF2の二重陽性を示す）との位置関係を明らかにする。
その後、体幹部で誘導するガイダンス因子と下顎突起から発する走化性因子の分子機能を確かめる目的で、体幹部を含む下顎突起の器官培養系での解析を開始し、リンパ管内皮細胞の移住とガイダンスに寄与することが想定されるVegfc・Ccbe1・Cxcl12・Cxcr4、ならびにDNAマイクロアレイ解析で候補に挙がった因子を対象として、モルフォリノAS-ODN・阻害剤・中和抗体の投与によるノックダウンを計画する。さらに、初年度に実施したmicroRNAマイクロアレイ解析で注目されたmicroRNAについて、microRNAが標的とするガイダンス因子（遺伝子）のin silicoでの検索・同定や、microRNAの全長をなすODNおよびantagomirを合成し、体幹部を含む下顎突起の器官培養系でリンパ管内皮細胞の移住とガイダンスに寄与するmicroRNAの役割を検証する。
|
