| 研究課題/領域番号 |
17K11633
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| 研究機関 | 鶴見大学 |
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研究代表者 |
松本 直行 鶴見大学, 歯学部, 学内講師 (20386080)
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| 研究分担者 |
梁 洪淵 鶴見大学, 歯学部, 講師 (10298268)
内田 仁司 鶴見大学, 歯学部, 学内講師 (20736996) [辞退]
井上 裕子 日本薬科大学, 薬学部, 教授 (50367306)
中山 亮子 鶴見大学, 歯学部, 助教 (50749843)
斎藤 一郎 鶴見大学, 歯学部, 教授 (60147634)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 唾液腺傷害 / EGFR2 / MUC-1 / apoptosis |
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| 研究実績の概要 |
唾液腺組織特異的傷害モデルマウス作出のためTRECK法を用いた。アミラーゼ遺伝子（AMY1C）のエンハンサー・プロモーター配列をTA-クローニングし、ヒト ジフテリアトキシン（DT）受容体が組み込まれたTRECKベクター（AMY1C-TRECK）を作製した。野生型マウスはDTに対して非感受性であるためDTを投与しても組織に影響はないが、細胞特異的にDT受容体を発現する遺伝子改変マウスにDTを投与すると、DT受容体を発現した細胞のみが傷害される。
この遺伝子を受精卵へマイクロインジェクションし、遺伝子改変マウスを作出した。トランスジーンの発現が確認されたF0マウスと野生型マウスを交配させ、F1世代ヘテロ型マウスの各種臓器におけるヒトDT受容体の発現を検討した。48系統のうち16系統の顎下腺にヒトDT受容体の発現を確認したが、複数の臓器に発現が見られたため、顎下腺に発現が強い１系統を維持している。本系統の顎下腺を摘出し培養液にDTを添加して臓器スライス培養を行った。DT添加群では培養組織に広範な壊死が生じ、顎下腺の組織傷害モデルとして利用できると考えられた。今後、EGFR2-MUC-1経路によるapoptosis抑制について検討する。
また唾液腺特異的に発現するMUC-7のプロモーター配列をTRECKベクターに組み込み、受精卵へマイクロインジェクションし、顎下腺特異的にDT受容体を発現する遺伝子改変マウスの作出を進めている。現在までにF0世代99匹のうち26匹にヒトDT受容体の発現を確認し、野生型マウスとの交配を進めている。F1世代のヘテロマウスで各種臓器におけるヒトDT受容体発現を検討し、唾液腺組織特異的傷害モデルマウスの樹立を目指している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまでに唾液腺組織で発現の高いAMY1C（アミラーゼ）のプロモーター配列を用いて唾液腺組織特異的傷害モデルマウス作出を進めていたが、脳や心臓などの重要臓器でトランスジーン発現が確認されたため、受精卵へのマイクロインジェクションを繰り返したため、実験計画に遅れが生じた。
しかし、顎下腺に発現が強い１系統が得られ、臓器スライス培養を応用した唾液腺傷害モデルの実験系を確立した。また前述のMUC7-TRECK遺伝子改変マウスの作出が進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
前述のように、唾液腺組織特異的にトランスジーンを発現している系統が得られなかった。しかし本研究で確立した遺伝子改変マウス（AMY1-TRECK系統）の唾液腺スライス培養の実験系を応用し、heregulin-EGFR2-MUC-1経路によるapoptosis抑制について検討を進める。
マウス生体におけるheregulin-EGFR2-MUC-1経路による唾液腺apoptosis抑制は本研究で重要な位置を占めるため、プロモーター領域をMUC-7に代えたTRECKベクター（MUC7-TRECK）を作製し、唾液腺組織特異的傷害モデルマウスの樹立を目指している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前述のように、唾液腺組織特異的にトランスジーンを発現している系統が得られず、実験の進捗が遅れたため繰越金が生じた。
前述のスライス培養によるEGFR-2/MUC-1経路を介したアポトーシス抑制によるin vitro実験と遺伝子改変マウス（MUC7-TRECK系統）作出のために繰越金額を使用する予定である。具体的には、唾液腺スライス培養のための培養液と関連試薬、アポトーシス検出試薬および各種抗体を購入する予定である。また、トランスジーンのスクリーニングなど分子生物学的操作に必要な試薬の購入費、繁殖のための正常マウスの購入費、動物飼育費として使用することを予定している。
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