| 研究課題/領域番号 |
17K11645
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
松田 美穂 九州大学, 歯学研究院, 講師 (40291520)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 破骨細胞 / 分化 / M-CSF / PRIP |
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| 研究実績の概要 |
シグナル分子PRIPの破骨細胞分化における役割を解明するために、初年度はPRIPの有無による破骨細胞分化の経時的変化の解析を行った。野生型（WT)およびPRIPノックアウト（KO）マウスにおいて、大腿骨および頭蓋骨より調製した骨髄細胞（BMC）および骨芽細胞前駆細胞（POB）を用いて共培養を行ったところ、KOマウス由来の BMC を用いた場合に分化した破骨細胞数が有意に減少した。そこで骨髄由来細胞の単独培養を行い、M-CSF、RANKL刺激による分化誘導の過程で細胞の経時的変化について検討したところ、分化の初期（M-CSF添加後1.5日および３日）において、WTに比べPRIP-KOで細胞の接着数が減少していることが分かった。また、TRAP染色を行ったところ、分化した破骨細胞数はWTに比べKOで少なく、核数別に細胞数を確認したところ、3-5個、6-10個、11個以上の分類のうち特に3-5個、6-10個においてKOで減少していた。つまり、多核化する以前までの過程でPRIP欠損による不具合が生じているものと考えられた。そこで、破骨細胞分化に必須のM-CSFおよびRANKLの受容体（CD115、RANK）についてその膜発現をFACSにて解析したところ、RANK/CD115陽性細胞数がM-CSFのみによる刺激の段階でKOで減少していた。破骨細胞分化および機能に関わる種々の分子群についてreal-time PCR解析を行ったところ、M-CSF受容体やNFATc1、PU1、αVβ3インテグリンなど分化初期に重要な分子の発現がPRIP-KOにおいて減少していた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定通り、PRIPの有無による破骨細胞分化の経時的変化を比較検討し、PRIP欠損により分化に支障を来す時期を絞り込むことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、PRIP-KOマウス骨髄由来細胞の代替として、CRISPR-Cas9法にてPRIP遺伝子を発現抑制した培養細胞株を構築 (RAW264.7-Pkd)する計画であるが、当研究室においてRAW細胞を分化誘導したあと多核の破骨細胞ができていることは顕微鏡下で確認できるもののTRAP染色での検出が安定しないことなどが生じているため、RAW細胞を用いたPRIPの発現抑制株を構築後TRAP染色等の系を確認しもしアウトプットが上手くいかなければ、PRIP-KOマウスにおける出産仔数の低下の影響は否めないがマウス骨髄より調製したものをPRIP-KO骨髄細胞として用い実験を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
計上していた動物飼育費３０万円が、大学の補助により今年度は支払わずに済んだため次年度使用額が生じた。その分を用いて次年度はマイクロアレイまたRNA sequence を行い、骨髄細胞および骨芽前駆細胞による共存培養においてPRIP-KO骨髄細胞を用いた時のみ分化した破骨細胞数が減少する際の遺伝子発現変化を検討する。
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