| 研究課題/領域番号 |
17K11658
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| 研究機関 | 愛知学院大学 |
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研究代表者 |
鈴木 崇弘 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (70298545)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 生物発光 / イメージング / 開口分泌 / インスリン / タンパク質分泌 / エキソサイトーシス / ルシフェラーゼ |
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| 研究実績の概要 |
膵島β細胞の同調した周期性インスリン分泌は、糖尿病のインスリン分泌障害と密接に関係することが知られているが、簡便に解析できる細胞株や解析手法が無かったことから、その分子機構はほとんど不明なままである。これまでの研究から、独自開発の「分泌タンパク質のビデオレート生物発光イメージング法」を用いて、グルコース刺激による周期性インスリン分泌の可視化が可能な発光膵 β 細胞株（iGL 細胞）を樹立した。三次元（3D）培養を行なった膵島様iGL細胞塊（スフェロイド）で生物発光イメージングを行った結果、細胞塊全体が完全に同調した周期性インスリン分泌が１時間以上持続するという、親株のINS-1E細胞を含めた他の細胞株では例のない特長を示した。さらにiGL細胞が定常発現するヒトインスリンとガウシアルシフェラーゼ（Gaussia Luciferase,GLase）の融合タンパク質（Insulin-GLase）の分泌については、生物発光イメージングに加えてルミノメーターを用いた定量解析が可能である。iGL細胞のグルコース応答性インスリン分泌について、ルミノメーターによる発光測定法と一般的に利用されているELISA法を比較した結果、発光測定法は検出感度が100倍以上高く、解析時間とコストも大幅に削減できた。このことからiGL細胞は同調性インスリン分泌機構解析と糖尿病薬の評価に有用と考えられた。次に、還元剤や細胞外マトリックスの有無など、iGL細胞を用いたグルコース応答性インスリン分泌を解析するための培養条件について最適化を行った。その結果、メルカプトエタノールやモノチオグリセロールなどの還元剤は、細胞の増殖には必須ではないが、グルコース応答性を高める上で必要であった。また培養器具のコーティング剤として、ポリDリジンよりも8倍希釈したマトリゲルの方が、高い細胞接着とグルコース応答性を両立させる上で、適していると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度の論文発表（Suzuki et al. BBRC, 2017）により、企業からiGL細胞の取り扱いについて申し入れがあったことを受けて、今年度は、還元剤や細胞外マトリックスの有無など、グルコース応答性インスリン分泌をルミノメーターで安定して測定できるiGL細胞の培養条件を検討し、最適化を行うことができた。このことにより、iGL細胞を周期性インスリン分泌の基礎研究や糖尿病薬の開発・評価に広く利用できる基盤ができた。その中で生物発光イメージング解析を行った結果、細胞集団で同調した周期性インスリン分泌を示す実験条件では、ルミノメーターによる測定によるグルコース誘導率も高く、インスリン分泌の同調性は、インスリン分泌量を増大させることが示唆された。また、iGL細胞の蛍光イメージングによる分泌小胞動態や細胞内カルシウム濃度測定と生物発光イメージングによる分泌動態解析の比較も進めた。以上のことから本研究は順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平面（2D）培養におけるiGL細胞の同調した周期性インスリン分泌を生物発光イメージングおよびルミノメーター測定により安定して定量解析できる実験系を確立したことから、次に三次元（3D）培養条件での最適化も行う。また、蛍光イメージングと生物発光イメージングによる解析を行い、同調した周期性インスリン分泌における分泌小胞動態と細胞内カルシウム濃度変化について解析を進める。最終的に、これらの研究成果について、学術論文発表を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度はiGL細胞培養条件の最適化に注力し、順調に研究が進んだことから、研究費が残る形となった。次年度使用額については、GLaseを用いた生物発光イメージングとルミノメーター測定解析に重要な、比較的高額となる発光基質の購入と、蛍光イメージングに使用するカルシウム測定試薬等の購入に利用する。
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