口腔細菌が規定する腸内環境を介した生体恒常性維持機能の解明

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K11661
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 中村 公則 北海道大学, 先端生命科学研究院, 准教授 (80381276)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 自然免疫 / Paneth細胞 / αディフェンシン

研究実績の概要

口腔と腸管は連続している一本の筒であり、口腔細菌が腸管に移行し腸内環境に影響を及ぼすことは容易に想像できる。近年、口腔細菌の肥満や糖尿病などの全身疾患への関与が知られてきている。また、腸管においては共生細菌叢組成の破綻（dysbiosis）による生活習慣病への関与が注目されているが、いずれもその実態は未解明である。本研究は、口腔細菌が腸管へ移行し、腸上皮との相互作用を介して生体の恒常性維持に密接に関与するとの仮説をたて、その機序を細胞・分子レベルで解明することを目的とする。申請者は腸上皮パネト細胞・αディフェンシンによる腸内環境制御が全身疾患発症の主要因であることを腸上皮三次元培養法やモデルマウスにより見い出しており、これらの手法を格段に発展させ、新たな生活習慣病への疾病予防・治療戦略を提案する。具体的には、腸管上皮培養法としてパネト細胞、内分泌細胞、杯細胞、 吸収上皮細胞そして幹細胞で構成されており生体腸管の構造を模しているエンテロイド培養法を応用する。エンテロイドは基質に包埋されており、また内腔側が閉鎖構造を保持することから、腸管内腔にアプローチした機能解析を定量的に行うことが難しい。そこで本研究では、初めにマイクロインジェクション法を利用して、エンテロイド内腔へ任意のリガンド投与を可能とする。次にパネト細胞の顆粒分泌を可視化・定量して新たな腸内環境評価法を樹立し、口腔細菌と腸管上皮との相互作用を細胞・分子レベルで解明する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究は、口腔と腸管における自然免疫機構を介したクロストークが存在し、口腔と腸管のリンクが正常な口腔内環境および腸内環境の維持やその破綻に関与しているとの仮説を立て、口腔細菌によるαディフェンシン分泌さらには内分泌細胞・消化管ホルモン分泌への影響及び、腸内細菌叢組成への関与を検討することで、歯周病や肥満、糖尿病などの生活習慣病をはじめとする全身疾患の発症や進行メカニズムの解明を目的とする。
平成29年度は、エンテロイドの腸管内腔へアプローチできるマイクロインジェクション法による生体腸管の管腔内を模倣した腸内環境評価法を樹立を試みた。
・エンテロイドを用いたin vitro腸内環境評価法の確立：エンテロイド培養法とマイクロインジェクション法を応用してエンテロイド腸管内腔部位へ任意リガンドの投与が可能となる腸内環境評価法を樹立した。この樹立した方法は、生体で口腔細菌が刺激する方向であるエンテロイド内腔側から、マイクロマニピュレーターを用いたマイクロインジェクション法によるアプローチを可能とした。
・パネト細胞の顆粒分泌量を共焦点レーザー顕微鏡による高解像解析により定量化できるシステムの構築：エンテロイド内腔に任意のリガンドを注入後、ステージ恒温チャンバー内で顆粒分泌量をライブイメージングし解析・数値化し、自然免疫への作用を定量・評価を可能とした。

今後の研究の推進方策

平成30年度は、エンテロイドを構成するパネト細胞、内分泌細胞の細胞内カルシウム動態を共焦点レーザー顕微鏡でライブイメージングできるペプチド分泌のメカニズム解析評価系を確立し、抗菌ペプチド、消化管ホルモンの分泌誘導物質のハイスループットな腸内環境評価法を構築する。また樹立した評価法の応用により、口腔常在菌である S. mitis、S. sanguinis、L. casei 等、あるいは病原菌である P. gingivalis、P.intermedia、A. naeslundii 等、また各種細菌由来抗原 (LPS、Lipid A、muramyl dipeptide、 lipoteichoic acid 等)をエンテロイド内腔に投与し、腸管上皮細胞との相互作用をパネト細胞顆粒分泌量測定・カルシウム動態のライブメージング解析により、口腔細菌と腸管上皮との相互作用を解明する。

研究成果

• [雑誌論文] R-Spondin1 expands Paneth cells and prevents dysbiosis induced by graft-versus-host disease (2017)
  • 著者名/発表者名: E. Hayase, D. Hashimoto, K. Nakamura, C. Noizat, R. Ogasawara, S. Takahashi, H. Ohigashi, Y. Yokoi, R. Sugimoto, S. Matsuoka, T. Ara, E. Yokoyama, T. Yamakawa, K. Ebata, T. Kondo, R. Hiramine, T. Aizawa, Y. Ogura, T. Hayashi, H. Mori, K. Kurokawa, K. Tomizuka, T. Ayabe, and T. Teshima
  • 雑誌名: J. Exp. Med 巻: 214 ページ: 3507-3518
  • DOI: 10.1084/jem.20170418
  • 査読あり
• [学会発表] Enteroidを用いたPaneth細胞が制御する腸内環境の機能解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 中村 公則、横井 友樹、米田 司、綾部 時芳
  • 学会等名: 日本農芸化学会2018年度大会
  • 招待講演
• [学会発表] 高純度ソーティング由来cDNAライブラリーを用いたPaneth細胞の新規機能探索 (2017)
  • 著者名/発表者名: 櫻木 直也、中村 公則、 横井 友樹、菊池 摩仁、綾部 時芳
  • 学会等名: 日本食品免疫学会第13回学術大会
• [学会発表] Enteroid内腔へのマイクロインジェクションによるPaneth細胞顆粒分泌評価システムの確立と応用 (2017)
  • 著者名/発表者名: 米田 司、中村 公則、横井 友樹、大平 修也、菊池 摩仁、櫻木 直也、綾部 時芳
  • 学会等名: 第40回日本分子生物学会年会
• [学会発表] クローン病モデルマウスSAMP1/YitFcにおけるPaneth細胞α-defensinのmisfolding (2017)
  • 著者名/発表者名: 清水 由宇、中村 公則、菊池 摩仁 、櫻木 直也、綾部 時芳
  • 学会等名: 第40回日本分子生物学会年会
• [学会発表] Evaluation system for receptor expression and function in the intestinal stem cell niche (2017)
  • 著者名/発表者名: Rina Sugimoto, Naoya Sakuragi, Yuki Yokoi, Kiminori Nakamura, Tokiyoshi Ayabe
  • 学会等名: 第46回日本免疫学会学術集会