2020 年度実施状況報告書

チロシンキナーゼ阻害分子 Sprouty による口腔癌リンパ節転移制御機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号	17K11692
研究機関	久留米大学
研究代表者	武富孝治久留米大学, 医学部, 講師 (10553290)
研究分担者	讃井彰一九州大学, 大学病院, 講師 (70507780) 福田隆男九州大学, 大学病院, 講師 (80507781)
研究期間 (年度)	2017-04-01 – 2022-03-31
キーワード	口腔癌
研究実績の概要	Ras-MAPK 経路は細胞増殖や分化に関わる重要な細胞内シグナル伝達経路で、そのネガティブフィードバック因子として知られている Sprouty ファミリーは口腔癌のみならず、肺がん・乳がん・大腸がん・卵巣がんなど、様々ながんの増殖抑制に作用していることが報告されている。 Sprouty ファミリーは哺乳類で 4 つのホモログが知られているが、なかでも Sprouty2 は古典的 MAPK (ERK1/2) 経路において、その受容体であるチロシンキナーゼ型受容体 (RTK) に結合する増殖因子によって異なる作用をすることが知られている。扁平上皮細胞株においても同様のことが認められ、上皮成長因子 (EGF) 刺激では ERK1/2 の活性化を増強し、線維芽細胞成長因子 (FGF) では ERK1/2 の活性化を抑制した。一方で、Sprouty の Homolog として単離された Spred は Sprouty ドメインをもち、EGF も FGF も共に抑制性に働くことから、まず抑制性に働く Spred の Sprouty ドメインの機能を調べることで、Sprouty2 の異なる機能の解明につながると考えた。Spred の C 末端側からリン酸化をうけるセリンやスレオニン、チロシンの特定の部位を欠損させた Delation mutant (dc5, dc10, dc26, dc56, dc80) を作成し、Ras との結合や Caveolin1 との結合を IP で解析した。その結果、全ての dc で Ras との結合を認め、活性化の場として知られる Raft fraction において、Caveolin1 と結合していることが判り、機能面では dc26 と dc56 の間で差がありそうな結果にはなったが、完全にその function を欠失させる結果にはならなかった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由 EGF と FGF 刺激における ERK1/2 の活性化に対する Sprouty2 の機能が逆であること理由を探るため、Sprouty ファミリーである Spred における Sprouty ドメインにそのヒントがあると仮定して、Loss of function になる deletion mutant の作成と解析に時間を費やすことで、本来の口腔癌細胞の増殖抑制に関わる Sprouty の機能解析の進歩が遅れる結果となった。しかしながら、Sprouty の機能を解明する上で、Sprouty ファミリーが共通して保存している Sprouty ドメインの解析により、この保存された Sprouty ドメインにおける Caveolin1 分子との結合が、Sprouty の作用に影響を受けている可能性が見出された。
今後の研究の推進方策	RTK のリガンドである増殖因子の種類によって ERK1/2 の活性化における Sprouty の機能が異なることに固執すると、本来の目的である Sprouty の口腔癌細胞における機能解析が複雑なものになってしまうことから、リガンドを 1 つに絞り、その増殖因子における ERK1/2 の活性化における Sprouty の影響を、Sprouty の中でも Sprouty2 と Sprouty4 に絞って解析していくことで、様々な癌細胞で増殖抑制に作用すると言われる Sprouty の口腔癌に与える影響が見えてくると考える。
次年度使用額が生じた理由	当初は研究室にない高額な機器(超遠心器や共焦点顕微鏡など)を用いた実験に関わる試薬（蛍光標識抗体など）を購入予定であったが、コロナ禍で共同研究者や研究室間の出入りが困難な状況があったため、これらを用いた実験は延期となったため、その分の購入資金を次年度へ回す必要が出てきた。同じく、学会発表においても、国際学会への出席が難しくなったが、次年度国内外を含めた学会参加が必要になれば、これに参加するため、その交通費および滞在費に使用する。さらに、研究の進歩状況が遅延しており、今後研究成果を国際雑誌に発表するにあたり、その APC として次年度まで持ち込む必要が出てきた。今後、自身が行う実験で研究の進展スピードが遅くなる可能性があれば、最終的には委託研究なども視野に入れて対応する必要があるため、これらに使用することも計画に入れている。