| 研究課題/領域番号 |
17K11698
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
八巻 惠子 東北大学, 歯学研究科, 助教 (90182419)
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| 研究分担者 |
佐藤 拓一 新潟大学, 医歯学系, 教授 (10303132)
鷲尾 純平 東北大学, 歯学研究科, 講師 (20400260)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 根管内フローラ / 歯内疾患 / パンゲノム / メタ16S解析 / V3-V4領域 |
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| 研究実績の概要 |
日常の歯科臨床でよく遭遇する根尖性歯周炎は、根管に侵入、定着した口腔内細菌が原因で生じる。ヒト口腔内から検出される細菌種はデータベース上600～700以上報告されているが、一個人が保有する口腔細菌は約100種といわれており、口腔フローラ構成菌種は個人差が非常に大きい。本研究の目的は、口腔細菌がどのような選択圧を受けて根管内に定着するのか、また根管フローラ構成菌種と臨床症状が相関するのか、V3-V4領域をターゲットとしたメタ16S解析を利用して検証することである。
東北大学病院歯周病科を受診した感染根管を有する患者からインフォームドコンセントを得て、唾液、プラーク、患歯の根管壁象牙質削片を採取した。根管サンプルは根管治療に用いる手用切削器具を利用して採取するため、サンプル中の細菌量は唾液やプラークに比較すると微量かつ定量困難である。そこで、パイロットスタディとして予備の根管サンプルを用いて細菌学的データを導出するプロトコールを比較検討した。その結果、根管の汚染状況にも左右されるが、#20～30サイズのファイル1本で採取したサンプルから抽出できるDNA量は0.3～2.0ng/μLと低濃度で、α多様性に乏しかった。また削片というサンプルの性状ゆえ、よく撹拌して均一化しないと、同じサンプルでもDNA濃度や細菌の系統・種にばらつきが出やすいことが判明した。感染根管のフローラを正しく解析するためには、複数のファイルを用いて根管壁削片をできるだけ多く削去し、サンプルを十分均一化してからDNA抽出処理をすることが必要であった。同定された菌種はBacteroidetes門、Firmicutes門、Proteobacteria門、Actinobacteria門が多く、いずれも唾液の主要菌門であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
ゲノム解析に必要な試薬が高価なことから、96ウェルプレートを用いて多くのサンプルを効率的に同時解析を進める予定でサンプル収集に注力したが、コロナウィルス流行による診療制限期間があり、またインフォームドコンセントを得られない場合もあった。さらに、狭窄・石灰化により根管にアクセスできないケースも複数経験し、サンプルがなかなか集まらなかった。
また、実験室での3密回避を目的とした実験研究制限期間もあり、パイロットスタディもままならず、サンプル処理のプロトコールを確立するまでに至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに収集できた根管壁象牙質、唾液、プラークサンプルについて、V3-V4領域をターゲットとしたメタ16S解析を進め、口腔各所に局在する際に口腔フローラにどのような選択圧がかかるのか、個人のデータおよび３群のデータを比較、考察する。種にとらわれず、属や科、門レベルで俯瞰することにより、感染根管フローラの特徴を見出し、根尖性歯周炎の治療と診断に活用する手法を考究する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウィルス流行による診療制限、実験研究制限期間があり、臨床研究が計画どおりに進捗せず、次年度に延長することとした。メタ16S解析を進めるのに必要な試薬・プラスチック器材の購入や、研究成果をまとめた論文の校閲、投稿料に充当する予定である。
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